焦旭雯，梁蔚陽，陳宇堃，蔣玉輝，陳龍少

廣東省藥品檢驗(yàn)所國家藥品監(jiān)督管理局血液制品質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510663

人血白蛋白是由健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法或經(jīng)批準(zhǔn)的其他分離法分離純化，并經(jīng)60℃10 h加溫滅活病毒后制成?！吨袊幍洹啡浚?020版）通則0904可見異物檢查法中規(guī)定，可見異物是指存在于注射劑、眼用液體制劑和無菌原料藥中，在規(guī)定條件下目視可觀測到的不溶性物質(zhì)，其粒徑或長度通常＞50μm［1］。由于人血白蛋白在生產(chǎn)和貯存過程中易產(chǎn)生蛋白顆粒聚集物，使蛋白質(zhì)在產(chǎn)品有效期內(nèi)發(fā)生變化，可能會明顯地檢測到蛋白絮或蛋白顆粒，其可見異物存在水平普遍高于化學(xué)藥品。本文對人血白蛋白中常見可見異物的形成原因、控制方法、安全限度的制訂、精密儀器檢測結(jié)果相關(guān)性等進(jìn)行示范性研究，旨在此基礎(chǔ)上，探索聚集體形成的原因，為擬定科學(xué)合理、具有引導(dǎo)性的可見異物研究與標(biāo)準(zhǔn)制訂指導(dǎo)原則提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 3批人血白蛋白可見異物陽性樣品（根據(jù)異物類型、蛋白顆粒聚集情況分為9份樣品，分類情況見表1）、1批靜注人免疫球蛋白（pH 4.0）批簽發(fā)樣品及1批人纖維蛋白原委托樣品由不同企業(yè)提供；TOSOHTSKGELG3000SW（7.5mm×600 mm）色譜柱購自日本東曹株式會社；B-2澄明度檢測儀購自天津大學(xué)精密儀器廠；GWF-8JDS微粒分析儀購自天津天河分析儀器有限公司；AccSizer 780全自動顆粒計數(shù)分析儀購自美國PSS-NICOMP公司；Agilent 1100高效液相色譜儀購自美國Agilent公司；2100AN濁度計購自美國HACH公司。

表1 3批人血白蛋白可見異物陽性樣品基本信息Tab.1 Basic information of three batches of sample containing visible particles

1.2可見異物檢測 按《中國藥典》三部（2020版）通則0904可見異物檢查法第一法（燈檢法），將澄明度檢測儀照度調(diào)節(jié)為4 000 Lx，分別將9份樣品置于黑、白背景下觀察。

1.3不溶性微粒檢測 按《中國藥典》三部（2020版）通則0903不溶性微粒檢查法第一法（光阻法），采用GWF-8JDS微粒分析儀對9份樣品進(jìn)行檢測。每個供試品容器中含10和10μm以上的微粒數(shù)不得超過6 000粒，含25和25μm以上的微粒數(shù)不得超過600粒。

1.4大粒子檢測 采用全自動顆粒計數(shù)分析儀，基于光阻（光消減）原理的單粒子光學(xué)傳感技術(shù)進(jìn)行測定。用系列標(biāo)準(zhǔn)粒子建立粒徑與強(qiáng)度信號大小的校正曲線。儀器測得樣品中粒子通過光感區(qū)產(chǎn)生的信號，根據(jù)校正曲線計算出粒子的粒徑及加權(quán)體積。直接用聚四氟乙烯管線將9份高濃度樣品注入儀器中，由儀器自動稀釋至合適的濃度后進(jìn)行檢測。

1.5多聚體含量檢測 按《中國藥典》三部（2020版）通則3121人血白蛋白多聚體測定法，采用Agilent 1100高效液相色譜儀，以TOSOHTSK GEL G3000SW（7.5 mm×600 mm）為色譜柱，流動相為含1%異丙醇的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），流速為0.6 mL/min，檢測波長為280 nm，對9份樣品的多聚體、二聚體及單體含量進(jìn)行測定。

1.6濁度檢測 采用濁度計對9份人血白蛋白可見異物陽性樣品、1批靜注人免疫球蛋白（pH 4.0）批簽發(fā)樣品及1批人纖維蛋白原委托樣品進(jìn)行濁度檢測。分別量取濁度標(biāo)準(zhǔn)貯備液［《中國藥典》三部（2020版）附錄0902，濁度為4 000 NTU］0、0.125、0.25、0.5 mL，加水稀釋并定容至100 mL，制成濁度值分別為0、5、10、20 NTU的標(biāo)準(zhǔn)液。取濁度標(biāo)準(zhǔn)液測定濁度，以讀數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)液濁度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將樣品放至比濁儀中，讀數(shù)，計算結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1可見異物 結(jié)果顯示，樣品中可見異物主要表現(xiàn)為白點(diǎn)（指不能辨清平面或棱面的白色物體）、色點(diǎn)（指帶有顏色的不能辨清平面或棱角的物體）、纖毛（指細(xì)小的纖維），見圖1。

圖1 典型陽性樣品圖（燈檢法）Fig.1 Typical positive samples（lamp test）

2.2不溶性微粒 結(jié)果顯示，9份樣品不溶性微粒均符合規(guī)定，見表2。

表2 不溶性微粒檢測結(jié)果Tab.2 Test results for insoluble particles

2.3大粒子 結(jié)果顯示，隨著蛋白顆粒聚集的不同程度，粒徑為40~70μm的大粒子所占比例呈增加趨勢，見圖2和表3。

表3 不同粒徑粒子數(shù)所占百分比（%）Tab.3 Percentages of particles at various diameters

圖2 PSSAPS380全自動顆粒計數(shù)分析儀Y9典型圖譜（光阻法）Fig.2 Typical charts of PSS APS380 fully-automatic particle counting analyzer（light blockage method）

2.4多聚體含量 結(jié)果顯示，白點(diǎn)、色點(diǎn)、纖維等陽性樣品差別不大，但不同程度蛋白顆粒聚集的陽性樣品多聚體含量趨勢平穩(wěn)，二聚體含量略高，見圖3和圖4（以Y9為例）。

圖3 多聚體、二聚體含量趨勢圖Fig.3 Trend of polymer and dimer contents

圖4 高效液相色譜圖Fig.4 HPLCchromatogram

2.5濁度對比 濁度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。各批陽性樣品濁度值（3.8~4.3 NTU）與人纖維蛋白原（20.0 NTU）、靜注人免疫球蛋白（pH 4.0）（10.9 NTU）濁度值相比，無明顯差異?！吨袊幍洹啡浚?020版）人纖維蛋白原、靜注人免疫球蛋白（pH 4.0）等品種外觀項下均規(guī)定可帶輕微乳光，考慮濁度大小與品種本身特性有關(guān)。

圖5 濁度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for turbidity test

3 討論

通過9份樣品不溶性微粒、全自動顆粒計數(shù)、多聚體含量、濁度等項目的檢測數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，不溶性微粒檢測結(jié)果易受氣泡、硅油及蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)生的多聚體或沉淀［2］的影響，白點(diǎn)、色點(diǎn)、纖維等陽性樣品（Y1~Y6）差別不大，但不同程度蛋白顆粒聚集的陽性樣品（Y7~Y9），全自動顆粒計數(shù)結(jié)果與二聚體含量趨勢一致。

產(chǎn)生可見異物的風(fēng)險的工藝關(guān)鍵點(diǎn)包括原液制備、配液、無菌過濾、灌裝，還包括西林瓶清洗、滅菌及干燥，膠塞清洗、滅菌及干燥。結(jié)合人血白蛋白生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)過程中溫度控制至關(guān)重要，是常見可見異物產(chǎn)生的關(guān)鍵因素［3］。人血白蛋白樣品中如出現(xiàn)可見異物，各生產(chǎn)工序、關(guān)鍵工藝控制參數(shù)、物料、設(shè)備均有所關(guān)聯(lián)，需對蛋白分離過程、蛋白精制、滅活、蛋白分裝、蛋白孵育等過程進(jìn)行全面調(diào)查。人血白蛋白生產(chǎn)過程中對溫度要求較高，融漿溫度、融漿循環(huán)水溫、組分Ⅰ、組分Ⅱ+Ⅲ、組分Ⅳ、組分Ⅴ制作溫度、超濾透析液溫度均需嚴(yán)格控制。由于溫度升高后出現(xiàn)沉淀反溶，雜蛋白去除不徹底，影響產(chǎn)品純度，造成產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定［4］。因此，在后續(xù)孵育、存放過程中可能有蛋白顆粒析出，導(dǎo)致產(chǎn)品可見異物不符合要求。通過對批簽發(fā)資料匯總，對人血白蛋白生產(chǎn)過程中各組分沉淀溫度進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)各企業(yè)組分Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ、Ⅴ制作溫度差異較大，組分Ⅳ制作溫度較為集中，主要為-5和-7℃。結(jié)合燈檢結(jié)果，組分Ⅳ-1、Ⅳ-4制作溫度低，有利于降低白點(diǎn)檢出率。

通過對企業(yè)生產(chǎn)工藝的研究，發(fā)現(xiàn)本文中可見異物陽性樣品（Lot1和Lot2）在產(chǎn)品分裝后段由于分裝泵來回摩擦，產(chǎn)生熱量，從而導(dǎo)致蛋白變性。主要發(fā)生在分裝后期，經(jīng)更換分裝泵后，情況有所緩解?？梢姰愇镪栃詷悠罚↙ot3）在組分Ⅳ制作過程中，蛋白分離間內(nèi)壓縮空氣限壓閥故障，導(dǎo)致反應(yīng)罐反應(yīng)液達(dá)到-4.4℃，不利于雜蛋白沉淀，造成本批次產(chǎn)品總燈檢合格率較低。產(chǎn)品中出現(xiàn)的白點(diǎn)，主要為不穩(wěn)定蛋白顆粒。

血液制品在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)異常情況，蛋白顆粒的聚集是這類異物產(chǎn)生的關(guān)鍵，由于在配液和過程階段均處于溶解狀態(tài)，過濾器并不能攔截這類異物，當(dāng)出現(xiàn)振蕩、壓力、摩擦、溫度變化等誘發(fā)因素后，蛋白聚集形成可見異物。通過4種檢測方法對樣品進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)可見異物陽性樣品的不溶性微粒、濁度檢測結(jié)果仍符合《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定，但二聚體含量、粒徑＞50μm的大粒子所占比重呈增加趨勢。

綜上所述，企業(yè)在對人血白蛋白可見異物進(jìn)行燈檢法的同時，通過測定二聚體含量、粒徑＞50μm的大粒子所占比重對生產(chǎn)線上的產(chǎn)品進(jìn)行在線監(jiān)督，有利于探索聚集體形成的原因，以評估產(chǎn)品總體質(zhì)量［5-7］。