王金冬，馬亞林，毛彤瑤，段招軍

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

諾如病毒（norovirus，NoV）屬于杯狀病毒科 （Caliciviridae）諾如病毒屬（Norovirus），是一類無包膜的單正鏈RNA病毒，也是導(dǎo)致病毒性急性胃腸炎（acute gastroenteritis，AGE）的重要病原體之一。NoV基因全長(zhǎng)約為7 500個(gè)核苷酸，包括3個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）［1］。ORF1編碼6種非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NSP），參與病毒的復(fù)制過程。ORF2編碼主要衣殼蛋白VP1，該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為59 000，可自組裝產(chǎn)生在形態(tài)和抗原性上與天然病毒粒子相似的病毒樣顆粒（virus like particles，VLP）［1］。VP1由S區(qū)和P區(qū)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，S區(qū)主要參與二十面體衣殼的形成，P區(qū)構(gòu)成衣殼外的突起部分，包含NoV主要中和位點(diǎn)，可與組織血型抗原（histo-blood group antigen，HBGA）受體和抗體結(jié)合［2］。ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2，該蛋白可能與病毒的組裝以及維持衣殼蛋白穩(wěn)定性有關(guān)［1］。

NoV可感染多個(gè)年齡階段的人群，特別是5歲以下的嬰幼兒。在輪狀病毒疫苗得到大范圍推廣的發(fā)達(dá)地區(qū)，NoV感染已成為兒童病毒性胃腸炎的最主要病因［3］。目前，NoV被分成10個(gè)基因組（GⅠ~GⅩ），其中大多數(shù)的人類感染與GⅠ和GⅡ病毒株有關(guān)，特別是GⅡ.4，是過去幾十年最主要的流行株，造成50%~70%的暴發(fā)［4］。GⅡ.4 NoV具有高度變異性，每2~4年就會(huì)出現(xiàn)新的變異株，取代以往的優(yōu)勢(shì)流行株。GⅡ.4 sydney株為一種新的變異株，2012年首次出現(xiàn)于澳大利亞，其后在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)造成大規(guī)模暴發(fā)流行，也是我國(guó)近年來最常見的報(bào)告毒株［5］。

由于缺乏有效的藥物和治療手段，疫苗的推廣和使用是控制NoV感染最有效的方式。但NoV疫苗的研發(fā)目前存在較多困難，原因之一是缺乏細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和廣泛可用且成功的動(dòng)物模型，導(dǎo)致減毒活疫苗、滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗的研究受阻，同時(shí)限制了非傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)和后續(xù)評(píng)價(jià)。近期有研究發(fā)現(xiàn)，人類NoV可在B細(xì)胞和人腸道干細(xì)胞分化的腸上皮細(xì)胞（human intestinal enteroid，HIE）中進(jìn)行培養(yǎng)，但由于病毒復(fù)制效率過低，該技術(shù)目前尚不能用于疫苗研發(fā)［6］。因此，NoV疫苗的研究方向主要集中在VLP、P顆粒等亞單位疫苗以及重組腺病毒載體疫苗等［7-9］。其中研究最為深入的是VLP疫苗，目前已有多家公司和機(jī)構(gòu)的研究成果進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段［9-10］。復(fù)制缺陷的5型腺病毒（HAdV5）載體是開發(fā)新型強(qiáng)效疫苗最有前途的平臺(tái)之一，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，免疫效果好等優(yōu)點(diǎn)［11-12］。HAd5雖然不是腸道病毒，但其易于在人類和其他物種中傳遞，且具有誘導(dǎo)黏膜免疫的潛力，具有廣闊的應(yīng)用前景［11］。美國(guó)Vaxart公司目前正在研發(fā)一種基于HAd5載體的口服NoV重組腺病毒疫苗，該疫苗使用雙鏈RNA作為佐劑，能有效提高體液免疫和黏膜免疫水平［13］。該研究目前已進(jìn)入臨床階段。

本研究以HAd5為載體，構(gòu)建包含ORF2（VP1）、ORF3（VP2）和3′UTR區(qū)的新型重組腺病毒載體疫苗，并與單獨(dú)表達(dá)VP1的重組腺病毒疫苗進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)新型疫苗誘導(dǎo)小鼠體液、黏膜和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、病毒及細(xì)胞 攜帶NoVGⅡ.4 sydney 2012（GenBank：OK148516）VP1、VP2和3′UTR區(qū)的質(zhì)粒（puc-VP1-2）由金唯智生物科技有限公司合成；純化后的NoV GⅡ.4 P顆粒由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒性腹瀉室提供；改良后的腺病毒載體pkAd5ES和HEK293細(xì)胞株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心洪院士實(shí)驗(yàn)室魯茁壯老師惠贈(zèng)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠18只，雌性，6～8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：110011211109361851。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)小鼠進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照中國(guó)疾控中心病毒病預(yù)防控制所動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（20201020058）。

1.3主要試劑及儀器 常用限制性內(nèi)切酶和同源重組酶購(gòu)自美國(guó)New England Biolab公司；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 3000為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；2×Trans-Start?FastPfu Fly PCR SuperMix、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG和抗β-actin小鼠單克隆抗體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；諾如病毒VP1和VP2兔源多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgA和鏈霉親和素購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；聚丙烯酰胺（PPA）-biotin標(biāo)記的H雙糖購(gòu)自新西蘭GlycoNZ公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液、小鼠IFNγELISPOT檢測(cè)試劑盒和小鼠IL-4 ELISPOT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Countess3購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.4重組腺病毒的構(gòu)建 以puc-VP1-2質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增VP1（含CMV啟動(dòng)子）和VP1+VP2+3′UTR（含CMV啟動(dòng)子）序列。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，VP1上游引物：5′-ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGC-3′，下游引物：5′-TATCTAGATCCGGTGGATCGGATATCGTTTTCACAGGGCTCTTCTTCTG-3′；VP1+VP2+3′UTR區(qū)上游引物與VP1同，下游引物：5′-CTATCTAGATCCGGTGGATCGGATATCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAGACA-3′。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃20 s，62℃20 s，72℃40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min后，電泳回收目的片段。將兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過同源重組的方式分別插入改造后的pkAd5ES腺病毒載體中，獲得兩種重組腺病毒質(zhì)粒。在外源基因插入位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。上游引物：5′-TTGGGCGTAACCGAGTAAGA-3′，下游引物：5′-AATTGCATTCATTTTATGTTTCAG-3′。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃20 s，50℃20 s，72℃40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將擴(kuò)增片段送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。使用Lipfectamine 3000將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，7～10 d后觀察細(xì)胞病變情況。重組腺病毒經(jīng)大量擴(kuò)增后，采用氯化銫密度梯度離心法進(jìn)行純化，TCID50法測(cè)定病毒滴度。

1.5外源基因表達(dá)的鑒定 將HEK293細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種6孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。分別感染純化后等劑量的pkAd5ES、pkAd5ESVP1和pkAd5ES-VP1-2重組腺病毒。感染48～72 h待細(xì)胞完全病變后收集細(xì)胞，各加入100μL RIPA裂解液，冰上放置2 min，13 000×g離心5 min，取上清，采用Western blot法檢測(cè)VP1和VP2在細(xì)胞中的表達(dá)情況：將處理后的蛋白樣品經(jīng)12%SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入諾如病毒VP1、VP2兔源多克隆抗體（均1∶1 000稀釋）和抗β-actin小鼠單克隆抗體（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h；ECL發(fā)光試劑盒曝光顯色。

1.6動(dòng)物免疫及標(biāo)本采集 將小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（pkAd5ES）、VP1組（pkAd5ES-VP1）和VP1-2組（pkAd5ES-VP1-2），每組6只。禁食12 h后給予100μL重組腺病毒，108IU/只。所有小鼠均采用灌胃給藥。共免疫2次，間隔3周，每次免疫前采集小鼠血液和糞便，進(jìn)行特異性IgG和IgA抗體檢測(cè)。加強(qiáng)免疫2周后處死小鼠，采集血液、糞便和脾臟，進(jìn)行ELISA和ELISPOT檢測(cè)。

1.7小鼠血清特異性IgG和IgA抗體檢測(cè) 采用ELISA法。將小鼠血液樣本室溫靜置1～2 h，3 000×g離心20 min分離血清，待檢。取小鼠新鮮糞便樣本，按照10%（W/V）加入無菌PBS，13 000×g離心10 min，取糞便上清待檢。將純化的NoV GⅡ.4 P顆粒加入ELISA板中，4℃包被過夜；PBST洗板3次，以5%脫脂奶粉于37℃封閉1 h；加入倍比稀釋的待測(cè)血清或糞便上清，同時(shí)以免疫前小鼠血清或糞便上清作為陰性對(duì)照，進(jìn)行同比例稀釋，37℃孵育1 h；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或IgA（1∶10 000稀釋），37℃孵育1 h；洗板后加入TMB顯色液，室溫避光作用10 min；加入1 mol/L磷酸終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。樣本孔A450值高于陰性對(duì)照孔2.1倍以上，且大于0.2判為陽(yáng)性，陽(yáng)性孔所對(duì)應(yīng)最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。將陰性血清（IgG滴度＜20）和糞便樣本（IgA滴度＜5）分別判為1和0，以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8HBGA結(jié)合阻斷試驗(yàn) 將純化的GⅡ.4 P顆粒加入96孔板中，4℃包被過夜；加入5%脫脂奶粉，37℃封閉2 h；PBST洗板后，將小鼠血清2倍系列稀釋，加入板中，37℃孵育1 h，同時(shí)設(shè)未加血清阻斷的孔作為對(duì)照；加入聚丙烯酰胺（PPA）-biotin標(biāo)記的H雙糖，4℃反應(yīng)過夜；加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶2 000稀釋），37℃孵育1 h；TMB避光顯色10 min；1 mol/L磷酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm的吸光度值。比較小鼠血清封閉前后的A450值。阻斷效價(jià)50%（BT50）指加入血清后能使NoV P顆粒與寡糖的結(jié)合效率下降50%，即與未加血清阻斷的對(duì)照組相比，A450值下降至少50%的最高血清稀釋度［14］。

1.9小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFNγ和IL-4水平的檢測(cè) 采用ELISPOT法。采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟，用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，在自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Countess3上進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISPOT操作：將細(xì)胞按4×105個(gè)/孔鋪板，加入GⅡ.4特異性刺激物刺激培養(yǎng)24 h；用冰冷的去離子水裂解細(xì)胞，重復(fù)洗滌后加入生物素標(biāo)記的抗體（1∶1 000稀釋），37℃孵育1 h；洗板后再加入HRP標(biāo)記的酶標(biāo)親和素（1∶1 000稀釋），37℃作用1 h；加入配置好的AEC顯色液，室溫避光靜置5～30 min；根據(jù)斑點(diǎn)生成情況選擇終止顯色時(shí)間，對(duì)陽(yáng)性斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8軟件的One-way ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。抗體滴度取對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組腺病毒的包裝及外源基因表達(dá)的鑒定

2.1.1重組腺病毒質(zhì)粒的PCR鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，pkAd5ES、pkAd5ES-VP1和pkAd5-ES-VP1-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別可見178、2 944和3 820 bp的目的條帶，大小均與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2的PCR鑒定Fig.1 Identification of pkAd5ES-VP1 and pkAd5ES-VP1-2 by PCR

2.1.2病毒滴度 經(jīng)大量擴(kuò)增和純化后，重組腺病毒pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2以及pkAd5ES（空載體）的病毒滴度分別為3.4×109、2.4×109和5×109IU/mL。

2.1.3VP1和VP2外源基因表達(dá)的鑒定 Western blot分析顯示，pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2感染細(xì)胞中均可檢出VP1蛋白條帶，大小約59 000，但兩者的表達(dá)量無明顯差異；VP2蛋白條帶僅在pkAd5ES-VP1-2感染細(xì)胞中檢出。提示兩種重組病毒均能在真核細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因。見圖2。

圖2 Western blot分析重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞后VP1和VP2的表達(dá)情況Fig.2 Western blotting of expressions of VP1 and VP2 in HEK293 cells infected with recombinant adenoviruses

2.2小鼠血清特異性IgG和IgA抗體滴度 ELISA結(jié)果顯示，灌胃2周后，VP1和VP1-2組小鼠血清VP1特異性IgG抗體滴度約為102，顯著高于對(duì)照組（P分別為0.020 8和0.043 4）；加強(qiáng)免疫后，試驗(yàn)組與對(duì)照組差距進(jìn)一步加大（P<0.000 1），抗體滴度達(dá)103左右。初次免疫和加強(qiáng)免疫后，VP1和VP1-2組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.996 6和0.984 1）。初次免疫后，VP1-2組小鼠糞便中IgA抗體水平明顯升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 1）；加強(qiáng)免疫后，試驗(yàn)組IgA抗體水平進(jìn)一步升高，且VP1-2組明顯高于VP1組（P=0.005 7）。見圖3。

圖3 灌胃后各組小鼠體內(nèi)VP1特異性IgG（A）和IgA（B）抗體水平的變化Fig.3 VP1-specific IgG（A）and IgA（B）antibody levels in mice in various groups after oral immunization

2.3HBGA s阻斷試驗(yàn) VP1-2組小鼠血清抗體對(duì)GⅡ.4 P顆粒與寡糖結(jié)合的阻斷效價(jià)（BT50＞50）明顯高于VP1組（BT50＜10），見圖4。

圖4 灌胃后小鼠血清抗體對(duì)P顆粒與HBGA結(jié)合的阻斷效果Fig.4 Blocking effect of serum antibody on binding of P particles to HBGA of mice after oral immunization

2.4小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFNγ和IL-4水平ELISPOT結(jié)果顯示，與VP1組比較，VP1-2組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)VP1特異性IFNγ和IL-4分泌細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，特別是IL-4（P=0.016 7），見圖5。

圖5 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)IFNγ（A）和IL-4（B）分泌水平的變化Fig.5 Levels of IFNγ（A）and IL-4（B）in spleen lymphocytes of mice

3 討論

在所有疫苗分類中，減毒活疫苗能夠提供最有效持久的免疫保護(hù)，但由于NoV難以進(jìn)行體外培養(yǎng)，導(dǎo)致減毒活疫苗、滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)受限，而病毒載體疫苗提供了一種類似活疫苗的方法，為高效NoV疫苗的開發(fā)提供了思路。非復(fù)制型Ad5腺病毒載體是一種成熟且安全有效的疫苗平臺(tái)，目前已參與了多種重要傳染性疾病疫苗的研發(fā)，如埃博拉、流感、COVID-19等，部分疫苗已在國(guó)內(nèi)上市［15-17］。HAd5載體目前面臨的最大問題是預(yù)存免疫（preexisting immunity，PEI）的影響，針對(duì)載體的抗體會(huì)削弱外源抗原的免疫效果。有研究發(fā)現(xiàn)，黏膜免疫可繞過PEI的影響，誘導(dǎo)針對(duì)編碼抗原的顯著免疫反應(yīng)［11，18］。而且黏膜感染是腺病毒的固有特征，重組腺病毒疫苗通過黏膜免疫有望獲得較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。黏膜免疫的途徑有很多種，包括口腔、鼻腔、直腸、結(jié)膜以及陰道，黏膜免疫疫苗研究的關(guān)鍵是選擇合理有效的黏膜免疫途徑［19］?？诜臃N是黏膜免疫的主要方式之一，其具有較好的免疫學(xué)優(yōu)勢(shì)和成本效益，包括易接種，能刺激較強(qiáng)的黏膜免疫反應(yīng)，以及誘導(dǎo)強(qiáng)大的系統(tǒng)免疫等，尤其適用于經(jīng)糞口途徑傳播的病原體［20］。但口服免疫同樣會(huì)受低pH值、蛋白水解酶和胃腸道環(huán)境中生物屏障的影響，限制疫苗的吸收［20］?？紤]口服疫苗的低效性，可通過增加疫苗免疫劑量來提升免疫效果，但這可能會(huì)增加免疫耐受的風(fēng)險(xiǎn)。因此，增加疫苗抗原的表達(dá)水平或提高其免疫原性是提升口服疫苗效力的重要手段之一。

VP2是ORF3區(qū)編碼的次要結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒衣殼內(nèi)部。該蛋白在杯狀病毒中相對(duì)保守，在病毒復(fù)制或組裝中發(fā)揮重要作用。有研究表明，VP2能有效促進(jìn)NoV VP1的表達(dá)，并提高其VLP的穩(wěn)定性，而且可能參與調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)［1］。在載體疫苗中共表達(dá)VP1、VP2蛋白以及3′末端的基因調(diào)控序列能夠提高VP1特異性細(xì)胞免疫和黏膜免疫反應(yīng)［21］。

本研究以HAd5為載體分別構(gòu)建了包含NoV VP1（pkAd5ES-VP1）以及VP1+VP2+3′UTR區(qū)（pkAd5ESVP1-2）的兩種重組腺病毒載體疫苗，并通過免疫動(dòng)物比較兩者的免疫原性。兩種重組腺病毒包裝時(shí)間為8 d左右，VP2的插入并未影響病毒的包裝效率。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VP1和VP2蛋白在感染細(xì)胞中高效表達(dá)，但VP2和3′UTR區(qū)的插入并未顯著增加VP1蛋白的表達(dá)量，這與其他研究結(jié)果不符［24］。本研究中VP2對(duì)免疫效果的影響可能更多與VP2蛋白本身有關(guān)。兩種重組腺病毒在免疫2周后均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答，加強(qiáng)免疫后血清總IgG水平進(jìn)一步增強(qiáng)。但無論是初次免疫還是加強(qiáng)免疫，VP1和VP1-2組之間并未出現(xiàn)明顯差異，說明VP2的存在對(duì)IgG的提升并無明顯效果。糞便IgA是反應(yīng)黏膜免疫最重要的指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，初次免疫后VP1-2組的IgA抗體水平明顯升高，且加強(qiáng)免疫后進(jìn)一步增強(qiáng)，VP1-2組顯著高于VP1組，表明VP2能有效促進(jìn)IgA抗體水平的增高，提升黏膜免疫效果。中和抗體是疫苗評(píng)價(jià)最關(guān)鍵的指標(biāo)，但由于NoV難以進(jìn)行體外培養(yǎng)，中和試驗(yàn)無法開展，目前多采用HBGAs阻斷試驗(yàn)替代中和試驗(yàn)［14］。HBGAs是一類復(fù)雜的碳水化合物，包含巖藻糖的寡聚糖，大量分布于呼吸道、腸道、泌尿生殖道的黏膜上皮細(xì)胞以及唾液、血液等體液中。不同的NoV基因型可能結(jié)合不同類型的HBGA。GⅡ.4結(jié)合譜最廣，可結(jié)合大部分HBGA分子，包括H抗原［23］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)GⅡ.4 P顆粒與H雙糖的結(jié)合作用是否被阻止，以評(píng)價(jià)血清抗體的中和效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，在血清總IgG相當(dāng)?shù)那闆r下，VP1-2組的阻斷效果明顯高于VP1組，表明VP1-2組產(chǎn)生了較多的中和抗體，這可能與VP2蛋白的插入有關(guān)，該蛋白上可能包含某些中和抗原位點(diǎn)，刺激多余中和抗體的產(chǎn)生，但由于VP2主要位于病毒衣殼內(nèi)，該觀點(diǎn)未得到佐證。IFNγ和IL-4水平是反應(yīng)細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。本研究通過ELISPOT方法對(duì)免疫小鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)特異性刺激后，VP1-2組產(chǎn)生的IFNγ和IL-4 SFC的數(shù)量多于VP1組，表明口服免疫中VP2的加入對(duì)細(xì)胞免疫具有一定的刺激效果。

目前尚無NoV疫苗上市，研究者從不同方面對(duì)NoV疫苗進(jìn)行創(chuàng)新研究，以期獲得更好的免疫效果。本研究將VP1+VP2+3′UTR區(qū)（VP1-2）作為抗原包裝進(jìn)腺病毒載體中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，相對(duì)于包裝VP1的重組腺病毒疫苗，VP1-2疫苗在口服免疫時(shí)能有效提升IgA、中和抗體以及IL-4水平。VP2是否可作為NoV重組載體疫苗的重要組成，以及采用不同免疫劑量、不同接種方式產(chǎn)生的免疫效果是否存在差異，仍需進(jìn)一步研究。