張丹萍　黎純　韓建林

摘 要：【目的】旨在利用分子標(biāo)記篩選純系綠殼蛋舊院黑雞，為后期組建純系綠殼蛋舊院黑雞核心群奠定基礎(chǔ)。【方法】通過在1 000只舊院黑雞群體中，應(yīng)用EAV-HP和ALV的插入整合開展DNA分子標(biāo)記篩選純系綠殼蛋舊院黑雞，通過PCR檢測和分析EAV-HP和ALV在舊院黑雞群體中的分布情況，研究綠殼蛋和隱性白羽在舊院黑雞群體中的基因型頻率和基因頻率?！窘Y(jié)果】在舊院黑雞群體中檢測到了大量的EAV-HP的插入整合，但只存在少量的綠殼蛋純合子（基因型為LC/LC）個體，占舊院黑雞群體的15.7%;檢測到了少量的ALV的插入整合，無純合子，只有18個（基因型為N/C、C/C）隱性白羽雜合子，占到整個群體的1.93%?！窘Y(jié)論】應(yīng)用DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，獲得了無隱性白羽的純系綠殼蛋雞，綠殼蛋率 100%。

關(guān)鍵詞：舊院黑雞;分子標(biāo)記;EAV-HP;ALV

中圖分類號：S831.2 文獻標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2022）04-0035-06

舊院黑雞是四川省萬源市特有的地方品種，其最顯著的特征為烏皮、黑羽、五豆冠、黑脛[1]。舊院黑雞散養(yǎng)歷史較長，受到混養(yǎng)外來品種的雜交影響，發(fā)生了遺傳漂移，品種退化嚴(yán)重[2]。建立的原種場由于保種資金投入不足，僅起到了機械性的保護作用，保種力度不夠，也沒有真正去挖掘舊院黑雞品種本身存在的優(yōu)良價值和特色性狀基因，對黑羽、烏皮烏肉、綠殼蛋的特異遺傳基因的挖掘和提純工作還處在起步階段。目前，國際上“生物物種資源主權(quán)”爭奪愈演愈烈，依法保種刻不容緩，保種的目的不光是保存，而是充分有效的利用，利用是最好的保護[3]。中央全面深化改革委員會第二十次會議通過《種業(yè)振興行動方案》，會議強調(diào)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化，種子是基礎(chǔ)，必須把民族種業(yè)搞上去，把種源安全提升到關(guān)系國家安全的戰(zhàn)略高度，集中力量破難題、補短板、強優(yōu)勢、控風(fēng)險，實現(xiàn)種業(yè)科技自立自強、種源自主可控。自2021年起，在全國范圍內(nèi)組織開展農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源普查，摸清我國農(nóng)作物、畜禽和水產(chǎn)種質(zhì)資源家底。四川省“十三五”農(nóng)作物及畜禽育種攻關(guān)實施方案中將種質(zhì)與基因資源的收集、保存、創(chuàng)制、鑒定和畜禽水產(chǎn)新品種（配套系）選育納入攻關(guān)任務(wù)。因此本項目由達州市畜牧技術(shù)推廣站牽頭，國際家畜研究所（LIRI）、銅仁學(xué)院共同參與研究，通過基因組標(biāo)記挖掘和保護原產(chǎn)地舊院黑雞優(yōu)異遺傳資源，其自然群體中，約有5%的個體產(chǎn)綠殼蛋[4]，我們前期和國際家畜研究所（ILRI）以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所（IASCAAS）通過對部分舊院黑雞群體以及其它4個綠殼蛋雞群體的研究，即5個綠殼蛋雞群體中EAV-HP在SLCO1B3基因5′-非編碼區(qū)插入整合頻率和類型的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過初步選育的舊院黑雞群體中攜帶較高頻率的EAV-HP整合，EAV-HP以反向插入的方式，整合在SLCO1B3基因的5-非編碼區(qū)，從而啟動了SLCO1B3基因在卵殼腺中的特異性表達，運輸膽綠素沉積在蛋殼上，完全符合綠殼蛋形成的分子遺傳學(xué)機制，導(dǎo)致雞產(chǎn)綠殼蛋，如圖1;但其中也存在少數(shù)攜帶ALV整合的雜合子個體，ALV插入整合在TYR基因的第4內(nèi)含子中，導(dǎo)致TYR基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的異常表達，從而形成隱性白羽性狀[5]，如圖2;但由于雜合子個體無法從表型進行判斷基因型，利用雙重PCR方法檢測不同群體中EAV-HP和ALV的整合情況，可以全部篩選出綠殼蛋雞群中少量存在的隱性白羽雜合子個體，實現(xiàn)快速檢測、篩選純系綠殼蛋舊院黑雞，可根據(jù)PCR檢測結(jié)果鑒定組群、選種選配、補飼培育，及時分析選育效果，不斷改進選育方法，為后期培育特色、優(yōu)質(zhì)、節(jié)糧、高產(chǎn)型新品種和配套系奠定基礎(chǔ)，實現(xiàn)了分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

選取來自四川省省級遺傳資源保種場、四川省省級畜禽核心育種場和舊院黑雞原種場——萬源恒康農(nóng)業(yè)有限公司舊院黑雞，通過科學(xué)篩選1 000只（母雞900只，公雞100只），在相同條件下飼養(yǎng);參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T33-2004）并結(jié)合生產(chǎn)實際情況飼養(yǎng)，自由飲水和采食[6]。

1.2 方法

1.2.1 血液中總DNA的提取 選取四川省萬源市原產(chǎn)地原種場4月齡舊院黑雞1 000只，其中母雞900只，公雞100只。用真空采血管進行翅下采血，-20 ℃ 冷凍后加干冰郵寄國際家畜研究所北京辦事處和銅仁學(xué)院，解凍后采用全血基因組DNA快速提取試劑盒（紅細胞裂解液、細胞核裂解液、蛋白沉淀液和DNA溶解液組成）提取DNA，然后溶于TE中。將已提取的DNA樣品用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果見圖3。

檢測結(jié)果顯示：泳道中的DNA樣品帶型清晰、整齊，無明顯的拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA完整性好，無明顯降解，可以作為模板DNA進行PCR擴增。提取的基因組DNA全部用ND-10001紫外分光光度計檢測其濃度和純度，結(jié)果顯示每個樣品的OD_260/280值均在1.8～2.0，表明基因型DNA的純度良好。根據(jù)檢測的濃度，取部分樣品DNA原液并稀釋到約50～100 ng/μL用于工作基因組DNA，剩余的DNA原液置于-20 ℃保存[1]。

1.2.2 PCR檢測EAV-HP在舊院黑雞群體中的分布 應(yīng)用“5個綠殼蛋雞群體中EAV-HP在SLCO1B3基因5-非編碼區(qū)插入整合頻率和類型的研究” [5]文章中所公布的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

采用PCR方法，檢測舊院黑雞基因組DNA是否有EAV-HP的插入整合。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的條帶類型，預(yù)期擴增出目的片段長度為364? bp和/或約190? bp，與分子量Marker I比較，擴增產(chǎn)物大小與目的長度一致且特異性好[1]，電泳結(jié)果見圖4。

1.2.3 PCR檢測ALV在舊院黑雞群體中的分布 應(yīng)用“兩種內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒在不同原雞和家雞基因組中插入整合分布的研究”[1]文章中所公布的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

采用雙重PCR檢測舊院黑雞群體的基因組DNA，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的條帶類型，擴增出目的片段長度為481 bp和/或345 bp，與分子量Marker I比較，擴增產(chǎn)物大小與目的長度一致且特異性好，電泳結(jié)果見圖5。

2 結(jié)果與分析

2.1 EAV-HP在舊院黑雞群體中的分布

試驗結(jié)果顯示：①在1 000只舊院黑雞群體中有43個（其中公雞9個，母雞34個）未擴增到分子標(biāo)記片段，無法完成后期的DNA分子標(biāo)記篩選;②在剩余的957個舊院黑雞群體中（母雞866只，公雞91只）檢測到了870個（基因型為LC /N、LC/LC）EAV-HP插入整合，占到整個群體的90.91%;其中866只母雞檢測到787個（基因型為LC /N、LC/LC）個體，占母雞群體的90.88%;91只公雞檢測到83個（基因型為LC /N、LC/LC）個體，占公雞群體的91.21%;③在957個舊院黑雞群體中有725個綠殼蛋雜合子（基因型為LC /N），占群體的75.76%;其中866只母雞中有651個綠殼蛋雜合子（基因型為LC /N）個體，占母雞群體的75.17%;91只公雞中74個綠殼蛋雜合子（基因型為LC /N）個體，占公雞雞群體的81.32%;④同時還發(fā)現(xiàn)存在少量的純合子（基因型為LC/LC）個體，957只舊院黑雞群體中有145個純合子（基因型為LC/LC），占群體的15.15%;其中866只母雞中有136個綠殼蛋純合子（基因型為LC/LC）個體，占母雞群體的15.70%;91只公雞中9個綠殼蛋純合子（基因型為LC/LC）個體，占公雞群體的9.89%;⑤還有87個（基因型為N/N）個體未檢測到EAV-HP插入整合，占到整個群體的9.09%;其中866只母雞中有80個個體（基因型為N/N），占母雞群體的9.24%;91只公雞有7個（基因型為N/N）個體，占公雞雞群體的7.69%。EAV-HP在舊院黑雞群體中的基因型頻率和綠殼蛋基因頻率見表3。

2.2 ALV在舊院黑雞群體中的分布

結(jié)果顯示：①在1 000只舊院黑雞群體中有68個（其中公雞7個，母雞61個）未擴增到分子標(biāo)記片段，無法完成后期的DNA分子標(biāo)記篩選;②在剩余的932個舊院黑雞群體中檢測到了18個（基因型為N/C、C/C）ALV插入整合在TYR基因第4內(nèi)含子中，占到整個群體的1.93%;其中839只母雞中有17個雜合子個體（基因型為N/C），占母雞群體的2.02%;93只公雞中有1個雜合子個體（基因型為N/C），占公雞群體的1.08%;純合子個體（基因型為C/C）均沒有被檢測到;③932個舊院黑雞群體中，有914個（基因型為N/N）個體未檢測到ALV插入整合，占到整個群體的98.07%;其中839只母雞中有822個（基因型為N/N），占母雞群體的97.97%;93只公雞中92個（基因型為N/N）個體，占公雞雞群體的98.92%。ALV在舊院黑雞群體中的基因型頻率和基因頻率結(jié)果見表4。

3 討論

本研究采用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，開展舊院黑雞群體中EAV-HP和ALV在舊院黑雞群體基因組中插入整合分布的情況的研究，發(fā)現(xiàn)了大量的EAV-HP和少量ALV特色性狀基因片段的插入整合，EAV-HP以反向插入的方式，整合在SLCO1B3基因的5-非編碼區(qū)，從而啟動了SLCO1B3基因在卵殼腺中的特異性表達，運輸膽綠素沉積在蛋殼上，完全符合綠殼蛋形成的分子遺傳學(xué)機制，導(dǎo)致雞產(chǎn)綠殼蛋;ALV插入整合在TYR基因的第4內(nèi)含子中，導(dǎo)致TYR基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的異常表達，從而形成隱形白羽性狀[7]。 有研究表明，但自然群體中，約5%的雞能夠生產(chǎn)藍殼蛋[8]， 舊院黑雞綠殼蛋的蛋殼強度極顯著高于褐殼蛋和白殼蛋[9-10]，且舊院黑雞綠殼蛋對白殼蛋呈顯性遺傳[11-12]。通過特定DNA分子標(biāo)記篩選技術(shù)，剔除隱性白羽雜合子個體，篩選出的舊院黑雞實驗群體產(chǎn)綠殼蛋率達到100%，實現(xiàn)了舊院黑雞綠殼蛋率從5%到100%的飛躍，完成了運用DNA分子標(biāo)記快速檢測、篩選純系綠殼蛋舊院黑雞，為后期培育純系綠殼蛋舊院黑雞新品種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)可以有效快速地選擇有利基因，提高選種的準(zhǔn)確性和可靠性，縮短育種時間，擴大群體規(guī)模，因此備受關(guān)注，本項目應(yīng)用分子標(biāo)記篩選純系綠殼蛋舊院黑雞，獲得了無隱性白羽的純系綠殼蛋雞，綠殼蛋率達100%，為后期組建舊院黑雞純系綠殼蛋核心群奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 王晨. 兩種內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒在不同原雞和家雞基因組中插入整合分布的研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[2] 張丹萍，黎純.舊院黑雞的保種工作[J].家禽科學(xué)，2021（08）：53-55.

[3] 張丹萍.利用是最好的保存——四川省達州市加強畜禽遺傳資源保護與利用工作[J].中國畜牧業(yè)，2013（08）：83-84.

[4] 徐恢仲，單天錫，許由，等.舊院黑雞藍殼蛋遺傳研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994（03）：212-214.

[5] 王晨，張丹萍，張浩，等.5個綠殼蛋雞群體中EAV-HP在SLCO1B3基因5′-非編碼區(qū)插入整合頻率和類型的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（10）：183-188.

[6] 劉嘉，李富貴，覃飛，等.舊院黑雞綠殼蛋群體的篩選及其與東鄉(xiāng)綠殼蛋雞純系雜交后代的生產(chǎn)性能雜種優(yōu)勢分析[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，36（06）：839-844+850.DOI：10.16036/j.issn.1000-2650.2018.06.019.

[7] 張丹萍，黎純，楊波，等.舊院黑雞的調(diào)查與研究[J].中國畜牧業(yè)，2020（20）：49-51.

[8] 徐桂芳，陳寬維，中國家禽地方品種資源圖譜. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003b：118

[9] 四川省畜牧獸醫(yī)研究所家禽研究室. 舊院黑雞綠殼蛋蛋殼品質(zhì)的測定及比較[J].四川畜牧獸醫(yī)，1986（01）：8-10.

[10] 楊昌明， 蔣小松，羅才英. 舊院雞蘭殼蛋與羅斯雞褐殼蛋的蛋殼強度和厚度的比較[J]. 中國家禽，1989（2）：15-16.

[11] 蔣小松，羅才英. 舊院雞藍色蛋殼性狀的遺傳及其與白色蛋殼性狀. [J]. 四川畜牧獸醫(yī)，1990（2）： 16-17.

[12] 徐恢仲，單天錫，許由，等.舊院黑雞藍殼蛋遺傳研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994（03）：212-214.

Molecular marker screening and application of assisted breeding of pure green-shelled eggs of Jiuyuan black chicken in Wanyuan City， Sichuan Province

ZHANG Danping LI Chun HAN Jianlin

（1.Dazhou Animal Husbandry Technology Promotion Station， Dazhou? 635000， China;

2.Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Beijing 100193， China;

3.International Livestock Research Institute（ILRI）， Nairobi 00100， Kenya）

Abstract： 【Objective】The purpose of this study is to use molecular markers to screen pure green-shelled egg old-style black chickens， and lay a foundation for the later establishment of a core group of pure green-shelled eggs from old-style black chickens. 【Method】In 1000 old-yard black chicken populations， DNA molecular markers were used to screen pure green-shell egg old-yard black chickens by using the insertion and integration of EAV-HP and ALV. The distribution of the black chicken population in the hospital was studied， and the genotype frequency and gene frequency of green shell eggs and invisible white feather in the black chicken population of the old hospital were studied. 【Result】A large number of EAV-HP insertion integrations were detected in the Jiuyuan black chicken population， but there were only a small number of green-shell eggs homozygous （genotype LC/LC） individuals， accounting for 15.7% of the Jiuyuan black chicken population ; A small amount of ALV insertion and integration was detected in the old hospital black chicken population， no homozygotes， only 18 （genotype N/C， C/C） invisible white feather heterozygotes， accounting for 1.93% of the entire population. 【Conclusion】Using DNA molecular marker-assisted breeding technology， pure line green-shell hens without invisible white feathers were obtained， and the green-shell egg rate was 100%.

Keywords：? Jiuyuan chickens;Molecular marker; EAV-HP;ALV