趙 鑫， 任朝琴， 戴先芝

桑葚醋發(fā)酵優(yōu)化及提取物抗氧化能力分析

趙 鑫， 任朝琴*， 戴先芝*

（阿壩師范學院 資源與環(huán)境學院，四川 阿壩 623000）

采用鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）還原法，以正交實驗結果分別確定發(fā)酵時間、酵母菌含量、醋酸菌含量、發(fā)酵溫度對桑葚人工發(fā)酵階段的影響；實驗表明，桑葚酒精發(fā)酵過程中總抗氧化能力最優(yōu)的條件為：蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，溫度30℃；桑葚醋發(fā)酵過程中總抗氧化能力最優(yōu)的條件為：酒精發(fā)酵時間為5 d，醋酸菌含量1%，溫度32℃；分別采用水楊酸法和DPPH法測得桑葚醋提取物對（?OH）自由基和DPPH自由基有很好的清除作用，其清除率分別可達92.63%、94.48%。實驗分析發(fā)酵型桑葚醋抗氧化能力變化的可能原因，并為發(fā)酵型桑葚醋能夠成為新型植物型提取天然抗氧化劑提供理論基礎。

桑葚；發(fā)酵工藝；抗氧化能力；自由基

桑葚（），系?？疲ǎ┥伲ǎ┥洌↙.）的干燥果穗[1]，使用價值很高，既可食用又可入藥，味甜汁多，酸甜可口，被譽為“民間圣果”[2]。現代藥理學研究表明，桑葚對人體有很好的補血、抗氧化、消除自由基等保健功效，因此，現階段被廣泛應用于人體造血干細胞的生長、分化等方面的研究。

研究發(fā)現，桑葚營養(yǎng)豐富，富含白藜蘆醇、花青素、蝦青素、維生素等多種營養(yǎng)成分[3]，既可以鮮食又可用作中藥材，作為水果和保健品具有廣泛的應用。但新鮮的桑葚果實運輸困難、不易保存、上市時間短；在食用方面并不能得到廣大消費者的喜歡，且桑葚成熟周期短，保存條件苛刻，上市周期短，且不方便運輸也成為了限制桑葚鮮果進一步發(fā)展的重要影響因素，因此將桑葚開發(fā)加工成其他產品很有必要的。

孫佳勰等[4]以桑葚為實驗原料，探究了相關物質在桑葚酒精發(fā)酵中的變化情況，分析了構成桑葚果酒的相關物質；孔燕等[5]以酵母菌株考察了對桑葚果酒感官品質的影響，確定了釀制桑葚果酒的較優(yōu)酵母菌株；陳麒等[6]研究了酵母接種量對桑葚果酒中甲醇含量的影響；呂行等[7]通過單因素和正交實驗研究了桑葚不同發(fā)酵階段的抗氧化活性能力變化規(guī)律，通過乳酸發(fā)酵的方式能有效提高產物的總抗氧化能力；決登偉等[8]研究了在高壓環(huán)境下分析了桑葚總酚、總黃酮和花色苷的變化情況，表明高壓環(huán)境下桑葚的抗氧化成分會不斷流失，進而影響其抗氧化能力；李柏榆等[9]通過正交實驗比較了純化前后的桑葚多酚含量，且純化后的桑葚多酚抗氧化能力較強。

針對“桑葚醋發(fā)酵”、“桑葚醋提取物”的現有研究現狀，本文歸納總結桑葚醋發(fā)酵過程的影響因素，通過單因素和正交水平實驗分析了桑葚酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過程中的產物生成情況確定桑葚醋的最適發(fā)酵條件，對能影響桑葚醋總抗氧化能力的相關因素做重點研究，在最適發(fā)酵條件下分析其桑葚醋提取物的抗氧化能力變化情況，研究了桑葚醋提取物其對（?OH）、DPPH自由基的清除能力，為桑葚醋提取物作為植物型抗氧化劑提供了一定的理論數據。

1 實驗

1.1 材料

本實驗采用的桑葚鮮果購置于汶川縣水磨鎮(zhèn)市場，經戴先芝副教授鑒定合格后低溫保存處理。

實驗用水為實驗室自制一次性蒸餾水；實驗試劑：磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、蔗糖、水楊酸、70 %乙醇、DPPH自由基醇溶液、乙酸乙酯、冰醋酸、無水乙醇、95 %乙醇均為實驗室購置的分析純試劑。

酵母菌種為安琪葡萄酒酵母，購置于安琪酵母股份有限公司；醋酸菌種為醋酸菌，購置于濟寧祥園生物科技。

1.2 實驗儀器

UV-1800PC紫外可見光光度計（上海美譜達儀器有限公司），JJ324BC分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠），HH?S11-2-S電熱恒溫水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），R-1001-VN旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.3 實驗方法

1.4 桑葚醋提取方法

實驗發(fā)酵階段結束后，將發(fā)酵得到的桑葚醋利用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮處理，在恒溫25℃的條件下，加入乙酸乙酯萃取進行萃取2次，萃取結束后加入無水乙醇進行離心處理，過濾上層清液，水浴加熱得到桑葚醋提取物。

1.5 總抗氧化能力檢測[10-12]

取1 mL桑葚醋提取物樣品，加入2.5 mL pH＝7.5的磷酸鹽溶液，2.5 mL K3Fe(CN)6溶液（1%），振蕩混合均勻，水浴反應30 min；加入3.0 mL三氯乙酸溶液（10%），離心處理600 s；取離心完成的上層清液1.5 mL，加入3.5 mL蒸餾水，0.5 mL FeCl3（1%），震蕩混合均勻。在吸光度為700 nm平行測定3次實驗數據，樣品溶液的吸光值越大，則表征待測液的還原力越強。

1.6 自由基清除能力測定

1.6.1（?OH）自由基清除能力測定[13-15]

在1 mL中蒸餾水中加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL、9 mmol/L H2O2溶液2 mL、振蕩混合均勻后靜置600 s，加入9 mmol/L水楊酸溶液2 mL、振蕩混合均勻后靜置0.5 h，以蒸餾水為參比溶液，在510 nm下測定吸光度0。取1 mL不同體積梯度的樣品為實驗組，按照上述步驟，在510 nm條件下平行測定3次實驗數據，然后按照式（1）計算樣品對（?OH）自由基的消除率1。

式中，0為空白對照液的吸光值，A為加入待測樣品后的吸光值，A為不加入水楊酸時待測樣品的吸光值。

1.6.2 DPPH自由基清除能力測定[16-18]

移取5 mL蒸餾水，加入 0.5 mmol /L DPPH自由基醇溶液5 mL，振蕩混合均勻后避光0.5 h，以蒸餾水為參比溶液，在517 nm下測定吸光度0。取5 mL不同體積梯度的樣品為實驗組，按照上述步驟，在517 nm條件下平行測定3次實驗數據，然后按照式（2）計算樣品對DPPH自由基的消除率2。

式中，0為DPPH溶液與無水乙醇混合后測定的OD517值，A為DPPH溶液與稀釋后樣品反應測得OD517值，A為無水乙醇與稀釋后樣品混合反應后測得OD517值。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1酒精發(fā)酵及正交試驗

在酒精發(fā)酵過程中，實驗設計了蔗糖加入量（10 g/100 mL、12 g/100 mL、14 g/100 mL、16 g/100 mL、18 g/100 mL）、酵母菌含量（1%、5%、10%、15%、20%）、發(fā)酵溫度（20、23、26、29、32℃）三個單因素，并在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，考察桑葚酒精發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化情況。酒精發(fā)酵過程單因素實驗結果見表1，正交試驗因素與水平見表2。

表1 酒精發(fā)酵過程單因素實驗結果

表2 酒精發(fā)酵L9(33)正交實驗因素設計

2.1.2醋酸發(fā)酵及正交試驗

在酒精發(fā)酵的基礎上，進一步設計實驗考慮酒精發(fā)酵時間（3、5、7、9、11 d）、醋酸菌含量（0.05%、1%、5%、7%、9%）、發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34℃）三個單因素，并在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，考察桑葚醋酸發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化情況。醋酸發(fā)酵過程單因素實驗結果見表3，正交試驗因素與水平見表4。

表3 醋酸發(fā)酵過程單因素實驗結果

表4 醋酸發(fā)酵L9(33)正交實驗因素設計表

2.2 正交實驗結果

2.2.1酒精發(fā)酵

在單因素數據基礎上，以正交水平實驗考慮蔗糖加入量、酵母菌含量、發(fā)酵溫度3水平對桑葚酒精發(fā)酵過程總抗氧化能力的影響，尋找最適的酒精發(fā)酵條件，其正交實驗結果和顯著性分析如表5、表6所示。

表5 酒精發(fā)酵L9(33)正交實驗結果與分析

（續(xù)表5）

表6 酒精發(fā)酵過程正交試驗的F值和顯著性分析

實驗結果以總抗氧化能力作為評價指標，以SPSS軟件對實驗數據進行分析處理，分析R值，可知三者影響其酒精發(fā)酵的順序為A（蔗糖加入量）＞C（發(fā)酵溫度）＞B（酵母菌含量），且條件為蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，溫度30℃，可較好的進行后續(xù)的醋酸發(fā)酵過程。

2.2.2醋酸發(fā)酵

在單因素數據基礎上，以正交水平實驗考慮酒精發(fā)酵時間、醋酸菌含量、發(fā)酵溫度3水平對桑葚醋酸發(fā)酵過程總抗氧化能力的影響，尋找最適的醋酸發(fā)酵條件，其正交實驗結果和顯著性分析如表7、8所示。

表7 醋酸發(fā)酵L9(33)正交實驗結果與分析

表8 醋酸發(fā)酵過程正交試驗的F值和顯著性分析

實驗結果以總抗氧化能力作為評價指標，以SPSS軟件對實驗數據進行分析處理，分析R值，可知三者影響其醋酸發(fā)酵的順序為A（酒精發(fā)酵時間）＞B（醋酸菌含量）＞C（發(fā)酵溫度），且條件為酒精發(fā)酵時間為5 d，醋酸菌含量1%，溫度32℃，可較好的進行后續(xù)的桑葚醋提取物分析研究過程。

2.2.3驗證性實驗

在正交實驗結果的基礎上，對桑葚酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的總抗氧化能力進行平行試驗驗證，實驗結果表明，酒精發(fā)酵A2B3C3和醋酸發(fā)酵A1B1C2組合都有較好的總抗氧化能力，其結果分別為54.45 mg/mL、77.61 mg/mL。從驗證性實驗結果可知，酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的相應實驗組合對后續(xù)的自由基清除率實驗是可靠有效的。

2.3 （·OH）自由基消除率測定結果

圖1為桑葚醋提取物清除（?OH）自由基的能力。由圖1可以看出，桑葚醋提取物濃度在2～10 mg/mL范圍時，清除能力隨濃度的提高而增加；在10～12 mg/mL范圍內時，清除能力隨濃度的提高而減少，其提取物濃度達到10 mg/mL時，樣品濃度的對（?OH）自由基消除能力最強，為92.63%，從實驗數據可知桑葚醋提取物對（?OH）自由基具有很好的清除率，具有較好的抗氧化性能。

圖1 桑葚醋提取物清除（?OH）自由基的能力

圖2 桑葚醋提取物清除DPPH自由基的能力

2.4 DPPH自由基消除率測定結果

由圖2可以看出，桑葚醋提取物濃度在2～10 mg/mL范圍時，清除能力隨濃度的提高而增加；在10～12 mg/mL范圍內時，清除能力隨濃度的提高而減少，其提取物濃度達到10 mg/mL時，樣品濃度的對DPPH自由基消除能力最強，為94.48%，從實驗數據可知桑葚醋提取物對DPPH自由基具有很好的清除率，具有較好的抗氧化性能。

3 結論

實驗以桑葚鮮果為原料，采用人工發(fā)酵的方法，根據單因素和正交水平實驗，以SPSS軟件對實驗數據進行分析，得到桑葚酒精發(fā)酵最優(yōu)因素為：蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，溫度30℃，在該實驗基礎上，進行桑葚醋酸發(fā)酵，可知在酒精發(fā)酵時間為5 d，醋酸菌含量1%，溫度32℃是其發(fā)酵的最優(yōu)因素。采用旋轉蒸發(fā)儀獲得桑葚果醋提取物，以紫外分光光度法測得桑葚醋提取物對（?OH）自由基和DPPH自由基有較強的清除效果，其清除率分別可達92.63%、94.48%，同時通過（?OH）自由基和DPPH的清除效率佐證了旋轉蒸發(fā)儀是提取桑葚醋提取物的一種有效方法。

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Optimization of Mulberry Vinegar Fermentation and Analysis of Antioxidant Capacity of Extract

ZHAO Xin, REN Chao-qin*, DAI Xian-zhi*

（Institute of Resources and Environment, Aba Teacher University, Aba 623000, China）

In this article, potassium ferricyanide reduction method was used to determine the effects of fermentation time, yeast content, acetic acid bacteria content and fermentation temperature on artificial fermentation process of mulberry through the orthogonal experiment results. The experimental results show that the optimal conditions of total antioxidant capacity were sucrose content of 14 g/100 mL, yeast content of 5% and temperature of 30℃. The optimal conditions of total antioxidant capacity in acetic acid fermentation of mulberry were as follows: Alcohol fermentation time was 5 d, acetic acid bacteria content was 1%, temperature was 32℃; Salicylic acid method and DPPH method were used to determine the hydroxyl radical and DPPH radical scavenging activity of Fructose Fruccini Vinegar extract. The scavenging rates were 92.63% and 94.48%, respectively. The experiment analyzed the possible reasons for the change of antioxidant capacity of fermented mulberry vinegar, and provided a theoretical basis for the fermented mulberry vinegar to be a new type of natural antioxidant extracted from plants.

mulberry; fermentation process; antioxidant capacity; free radical

O656.6

A

1009-220X(2022)01-0057-08

10.16560/j.cnki.gzhx.20220108

2021-06-21

2019年四川省阿壩師范學院省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號S201910646099）；2020年四川省阿壩師范學院國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號202010646027）。

趙鑫（1998～），男，漢族，四川資陽人，本科；主要從事化學研究。

任朝琴（1982～），女，藏族，四川小金人，副教授；主要從事民族藥物學研究。

戴先芝（1983～），男，漢族，山東東平人，碩士，副教授；主要從事民族藥物學研究。