楊 濤，李佳思凡，靳圓圓，王水泉，牛淑亮

(新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊830011)

急性骨骼肌損傷是由于患者“經(jīng)脈不通，血氣不行”，導(dǎo)致的 “氣滯血瘀”。消腫噴劑是以蘇木、梔子等為基礎(chǔ)方，采用現(xiàn)代工藝制成的中藥噴劑[1]，具有較好的活血化瘀止痛和抑制急性骨骼肌損傷組織炎性因子表達(dá)等作用[2]。為進(jìn)一步明確消腫噴劑促進(jìn)急性骨骼肌損傷炎癥修復(fù)的作用機制，研究炎癥在急性骨骼肌損傷修復(fù)過程中的作用機制，我們用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)C2C12小鼠成肌細(xì)胞，造成體外細(xì)胞炎性模型，研究NO抑制劑(L-NAME)、NO供體(SNP)和消腫噴劑主藥對該體外炎癥模型炎癥因子IL-1β、IL-18及NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 C2C12小鼠成肌細(xì)胞來源于豐暉生物，細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM(高糖)培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(PS)，37 ℃，5% CO2，飽和濕度。實驗細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 消腫噴劑主藥含藥血清制備 參照文獻(xiàn)方法[3]，將蘇木、梔子、姜黃、乳香、沒藥按照5∶5∶3∶2∶2比例混合，制備消腫噴劑主藥含藥血清，備用。

1.3 主要實驗儀器 酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司，型號iMark)，PCR儀(美國Bio-Rad公司，型號MyCycler Thermal Cycler)，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司，型號Mini-PROTEAN Tetra system)，電泳儀(北京六一公司，型號DYCZ-24DN)。

1.4 主要試劑 CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒購自全式金生物公司；LPS購自SIGMA公司；L-NAME購自美侖生物公司；SNP購自Sigma公司；Mouse IL-18 ELISA Kit試劑盒購自聯(lián)科生物公司；Mouse IL-1β ELISA Kit試劑盒購自聯(lián)科生物公司；Anti-ASC antibody購自博奧森公司；Anti-NALP3/CIAS1 antibody購自博奧森公司；Anti-Caspase-1 P10 antibody購自博奧森公司。

1.5 炎癥模型評估 參照文獻(xiàn)方法[4-5]，LPS干預(yù)C2C12細(xì)胞，進(jìn)行體外炎癥模型造模。取生長狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的C2C12細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制備成5×104個/ml單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中(100 μl/孔，即5×103個/孔)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁后，分為空白組和LPS干預(yù)組兩組，每組5個重復(fù)；干預(yù)完成后，棄去孔中培養(yǎng)基，每孔加入100 μl配置好的10% CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育，1 h后酶標(biāo)儀450 nm波長檢測OD值，并收集細(xì)胞上清，進(jìn)行IL-1β、IL-18檢測。

1.6 炎癥模型實驗分組及干預(yù)方法 分為空白對照組、LPS干預(yù)組、NO抑制組、NO激動組和消腫噴劑主藥含藥血清組(含藥血清組)五組。

空白對照組正常培養(yǎng)6 h；LPS干預(yù)組：LPS(100 ng/ml)干預(yù)6 h；NO抑制組：LPS(100 ng/ml)+L-NAME(2.7 μg/ml)干預(yù)6 h；NO激動組：LPS(100 ng/ml)+SNP(8.94 μg/ml)干預(yù)6 h；含藥血清組：LPS(100 ng/ml)+含藥血清干預(yù)6 h。

1.7 ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-18蛋白表達(dá) 按炎癥模型實驗分組及干預(yù)后模式，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行IL-1β、IL-18檢測。

1.8 qRT-PCR檢測ASC、NLRP3、Caspase-1基因表達(dá)情況 按照實驗分組及干預(yù)模式，棄去每組細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基，加入1 ml Trizol消化細(xì)胞，使Trizol平鋪在細(xì)胞層面上，反復(fù)搖晃細(xì)胞培養(yǎng)瓶，直至細(xì)胞消化下來，裝入1.5 ml EP管中。后續(xù)實驗按照qRT-PCR試劑盒說明操作。

1.9 Western blot檢測ASC、NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)情況 按照實驗分組及干預(yù)模式，棄去每組細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基，加入3 ml無菌的PBS緩沖液反復(fù)沖洗2遍，棄去PBS緩沖液，用胰酶消化細(xì)胞。離心后棄去上清留細(xì)胞沉淀，用5 ml無菌PBS洗1遍后收集細(xì)胞。后續(xù)按照Western blot試劑盒說明操作。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 炎癥模型評估 LPS干預(yù)后，C2C12細(xì)胞增殖及細(xì)胞上清IL-1β、IL-18表達(dá)情況，見表1。LPS干預(yù)組與空白對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；細(xì)胞上清IL-1β比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；IL-18表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 LPS對各組C2C12細(xì)胞增殖及IL-1β、IL-18的影響

2.2 LPS、L-NAME、SNP和消腫噴劑主藥含藥血清對C2C12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18含量的影響 見表2。按照實驗分組，分別應(yīng)用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消腫噴劑主藥含藥血清干預(yù)后，ELISA檢測各組C2C12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18含量結(jié)果。

表2 各組C2C12細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18含量比較(pg/ml)

IL-1β含量比較，空白對照組與各干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS干預(yù)組與各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

IL-18含量比較，空白對照組與各干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS干預(yù)組與NO激動組、含藥血清組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與NO抑制組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 LPS、L-NAME、SNP和消腫噴劑主藥含藥血清對C2C12細(xì)胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平的影響 按照實驗分組，分別應(yīng)用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消腫噴劑主藥含藥血清干預(yù)后，qRT-PCR檢測小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平，見表3。Western blot檢測結(jié)果各組小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平，見表4。

表3 各組C2CL2細(xì)胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 mRNA表達(dá)水平比較

表4 各組C2CL2細(xì)胞中ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白水平比較

ASC mRNA表達(dá)水平，空白對照組與LPS干預(yù)組、NO抑制組、NO激動組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LPS干預(yù)組與NO抑制組、NO激動組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Caspase-1及NLRP3 mRNA表達(dá)水平，空白對照組與各干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS干預(yù)組與各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

ASC 蛋白水平，空白對照組與LPS干預(yù)組、NO抑制組、NO激動組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LPS干預(yù)組與NO抑制組、NO激動組、含藥血清組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

空白對照組與各干預(yù)組Caspase-1、NLRP3蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS干預(yù)組與各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

外因可致經(jīng)筋受損，氣機不暢，筋肉失于濡養(yǎng)，“凝血蘊里不散”，發(fā)為紅腫熱痛。中醫(yī)的“筋”實指解剖學(xué)肌肉[6]，因此急性骨骼肌損傷是由于“經(jīng)脈不通，血氣不行”，導(dǎo)致的 “氣滯血瘀”。

消腫噴劑主藥蘇木、梔子、姜黃、乳香、沒藥等具有較強的活血、祛瘀、行氣功效[1]。NO是由L-精氨酸合成的信號分子[7-9],NLRP3炎癥小體是由ASC、Caspase-1、NLRP3組成的多蛋白復(fù)合體，炎癥刺激能夠誘導(dǎo)NLRP3炎性小體發(fā)生寡聚化，同時募集相關(guān)反應(yīng)蛋白[10-12]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，消腫噴劑主藥蘇木乙醇提取物caesppanin A和tectorigenin，能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞釋放NO,發(fā)揮抗炎作用[13];梔子主要有效成分藏紅花素能夠抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中一氧化氮合酶(iNOS)的產(chǎn)生和血清TNF-α、IL-1β和 IL-6表達(dá)[14],梔子苷通過NLRP3/ASC/Caspase-1途徑，抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型，炎癥細(xì)胞浸潤、IL-1β、IL-18等炎癥因子產(chǎn)生[15]；姜黃素能夠通過調(diào)控SIRT1激活途徑[16]和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑[17]影響炎癥反應(yīng)；乳香、沒藥能夠通過抑制 NF-κB和MAPK 信號通路[18-20]的活性等抑制炎性介質(zhì)的釋放。

為了進(jìn)一步研究消腫噴劑促進(jìn)急性骨骼肌損傷炎癥修復(fù)的作用機制及NO在急性骨骼肌損傷修復(fù)過程中的作用機制，我們進(jìn)行了消腫噴劑主藥對體外炎癥模型IL-1β、IL-18及NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)影響的實驗研究。

實驗中我們應(yīng)用LPS干預(yù)C2C12細(xì)胞，成功復(fù)制了體外炎癥模型。分別應(yīng)用NO抑制劑L-NAME、NO激動劑SNP以及消腫噴劑主藥含藥血清對造模細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù)C2C12細(xì)胞，造成體外炎癥模型，IL-1β、IL-18表達(dá)明顯。應(yīng)用NO抑制劑L-NAME，抑制NO表達(dá)，IL-1β、IL-18表達(dá)明顯提高，而應(yīng)用NO活化劑SNP，進(jìn)一步活化NO表達(dá)，IL-1β、IL-18表達(dá)明顯降低，應(yīng)用消腫噴劑主藥含藥血清干預(yù)C2C12細(xì)胞外炎癥模型，能夠顯著降低IL-1β、IL-18表達(dá)；qRT-PCR檢測小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平以及Western blot檢測結(jié)果小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞體外炎癥模型，應(yīng)用NO抑制劑L-NAME和NO活化劑SNP，ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達(dá)水平和蛋白水平均明顯提高L-NAME或降低SNP，消腫噴劑主藥含藥血清有類似SNP作用，能夠顯著降低ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)。

基于以上實驗我們推斷，LPS激活NO-NLRP3-IL炎癥軸，誘導(dǎo)建立C2C12細(xì)胞體外炎癥模型。NO通過NO/ASC/Caspase-1/NLRP3/IL-1β/IL-18軸，調(diào)控骨骼肌體外炎癥模型炎癥因子表達(dá),消腫噴劑可能通過干預(yù)NO表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)。