周園園，戴志娟，張淑君，李岳春，戴元榮，王 賀，吳海林，馮夢晴，李校堃，黃曉暉，朱光輝

新型冠狀病毒疾病2019(coronavirus disease 2019, COVID-19)，由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引起，已成為全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件[1]?；颊咭园l(fā)熱為主要表現(xiàn)。嚴重者發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克等。確診患者死亡率達4.3 %[2]。目前尚無特效藥物，國家衛(wèi)健委先后發(fā)布了多版診療方案，推薦使用安宮牛黃丸和醒腦靜注射液，其組方中均含莪術[3]。莪術根莖提取的莪術油為莪術油注射液的主要成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗病原體等多種藥理作用。研究顯示SARS-CoV-2與SARS中的酶具有高水平的序列相似性[4]，SARS患者進行中西醫(yī)結合治療(憋喘期，聯(lián)用莪術油注射液)，臨床癥狀嚴重程度顯著改善，重癥患者病死率低[5-7]。故推測莪術油注射液對SARS-CoV-2也可能有效?，F(xiàn)對莪術油注射液體內外抗新型冠狀病毒作用進行研究，評價該藥治療COVID-19的有效性和安全性，以期為COVID-19治療提供更多的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與細胞株 莪術油(浙江天瑞藥業(yè)有限公司，批號：5190527，濃度：1 000 μg /ml)；莪術油注射液(浙江天瑞藥業(yè)有限公司，莪術油含量10 ml ∶0.1 g，國藥準字H20064312)。人腎上皮細胞株293 T(由中科院合肥物質科學研究院健康所惠贈)。

1.1.2試劑與儀器 轉染試劑Lipofiter 3.0[漢恒生物科技(上海)有限公司，貨號：HB-LF3-1000]；Opti-MEM(1X)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，貨號：31985-070)；Renilla-Glo熒光素酶檢測系統(tǒng)(普洛麥格生物技術有限公司，貨號：E2720)；pHB、pAX 2、SARS-CoV-2 S、ACE 2-pcDNA 3.1由合肥中科普瑞昇生物醫(yī)藥科技有限公司構建。細胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC1000)，酶標儀(珀金埃爾默股份有限公司，型號：EnVision)。

1.2 莪術油體外抗新冠類病毒作用實驗采用Renilla-Glo熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測莪術油抗SARS-CoV-2類病毒活性作用。

1.2.1細胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的293T細胞，37 ℃融化復蘇細胞，在超凈工作臺內，將細胞懸液轉移到含有2 ml培養(yǎng)基的無菌離心管中，800 r/min離心5 min，棄去上清液，加入適量DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞后轉移至培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件為37 ℃、5 %CO2、相對濕度75%)中培養(yǎng)兩代，待測試。

1.2.2類病毒及293T-ACE2細胞準備 提前20～24 h將293 T細胞接種至6孔板中，當細胞匯合度達到60%～70%時，分別使用轉染試劑Lipofiter 3.0將3 μg質粒[pHB：pAX 2：SARS-CoV-2 S(2 ∶2 ∶1)]和3 ug質粒(ACE2-pcDNA 3.1)進行包裝轉染，將6孔板在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，轉染48 h后收取病毒上清溶液，病毒立即使用或-80 ℃凍存保管。

1.2.3細胞消化 瞬時轉染48 h后，用胰酶將293T-ACE2消化，用完全培養(yǎng)基重懸細胞后，利用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)后，接種至96孔板，每孔體積為50 μl(25 000個細胞/孔)，在37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁。

1.2.4溶液制備 取莪術油50 μl，加入50 μl DMEM，先橫向梯度設置2×稀釋，再縱向稀釋10倍，取10 μl加96孔板，重復3次。

1.2.5鋪板讀數(shù) 取出培養(yǎng)箱中貼壁12 h的96孔白色細胞培養(yǎng)板，取10 μl制備好的樣品溶液加入上述含有50 μl細胞的96孔培養(yǎng)板中,每個濃度梯度3個復孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，每孔加入40 μl制備完成的類病毒溶液，并加入終濃度6 μg/ml的增強劑，再將培養(yǎng)板置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換100 μl新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測。將Renilla-Glo熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測試劑融化并放置至室溫，取出細胞培養(yǎng)板放置10 min使其平衡至室溫，在每孔中加入100 μl的檢測試劑，將培養(yǎng)板在軌道搖床上振搖2 min以誘導細胞裂解，培養(yǎng)板在室溫放置5 min以穩(wěn)定發(fā)光信號，在酶標儀讀板器上檢測發(fā)光信號。酶標儀檢測得出對應的每孔熒光值(relative light unit，RLU)。計算不同濃度化合物對應的相對熒光值RLU比率(%)采用下列公式：相對熒光值RLU比率(%)=RLUDRUG/RLUDMSO×100%。

1.3 莪術油注射液體內抗新型冠狀病毒作用研究采用隨機、開放、平行對照臨床試驗設計。該項臨床研究申辦方為合肥市未來藥物開發(fā)有限公司，并已獲得溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(倫理批準編號：LCKY2020-11)。

1.3.1研究對象 選取2020年2月至3月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院甌江口院區(qū)住院且同意(簽署知情同意書)參加本試驗的新冠肺炎患者，隨機分配至試驗組或對照組，兩組等比例分配。

1.3.2納入和排除標準 納入標準：① 年齡≥ 18周歲，性別不限；② 咽拭子標本實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性，或咽拭子陰性伴肺部影像學未完全吸收；③ 臨床分型為普通型或重型；④ 已簽署知情同意書。

排除標準：① 已知或懷疑對莪術油注射液組成成分過敏，或過敏體質。② 輕型與危重型患者。③ 合并嚴重的肝臟疾病(如Child-Pugh評分≥C級，總膽紅素(total bilirubin，TBIL)≥2倍正常值上限，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase ，ALT)/ 谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)≥5倍正常值上限)。④ 合并有重度腎功能不全[估算的腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)≤30 ml/(min·1.73 m2)]或正在接受連續(xù)性腎臟替代治療、血液透析、腹膜透析。⑤ 妊娠期、哺乳期婦女或在試驗期間及結束6個月內有生育計劃。⑥ 入組前3個月內參加過其他臨床試驗。⑦ 根據(jù)研究者的判斷，具有不適合參加本試驗的其他情況者。

1.3.3治療方法 所有受試者統(tǒng)一按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[3]給予常規(guī)治療: 選用α-干擾素(每次500萬U或相當劑量，加入滅菌注射用水2 ml，每日2次霧化吸入)和利巴韋林(500 mg/次，每日2至3次靜脈輸注，療程不超過10 d)，同時給予有效氧療措施；試驗組將在常規(guī)治療基礎上給予莪術油注射液20 ml于250 ml 0.9%氯化鈉注射液稀釋后緩慢滴注，每日1次，連續(xù)用藥7 d，不滿7 d出院則用至出院時(停藥后觀察期不滿14 d提前出院者需在滿14 d后回院訪視)。

1.3.4觀察指標 主要療效指標：① 咽拭子標本實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸轉陰率(用藥結束后)和轉陰時間；② 臨床改善的時間(time to clinical improvement, TTCI)；③ 通過胸部CT檢查病變區(qū)域的大小變化情況；④ 退熱時間。

次要療效指標：① 臨床恢復時間(time to clinical recovery，TTCR)定義：從開始治療到發(fā)熱、呼吸頻率、血氧飽和度轉為正常和咳嗽癥狀消失，持續(xù)至少48 h。正常的評估標準：發(fā)熱：腋溫≤ 37 ℃；呼吸頻率：≤24次/min(室內空氣下，如果患者吸氧，需注明氧療方式及濃度)；血氧飽和度：>93%(室內空氣下，如果患者吸氧，需注明氧療方式及濃度)。② 病情進展的病例比例參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》，病情分型由普通型轉為重型/危重型以及重型進展為危重型的病例比例。③ 咳嗽消失率和消失時間：入組時存在咳嗽的受試者咳嗽癥狀消失的時間和病例比例。④ 全因死亡率。

安全性指標：收集與監(jiān)測發(fā)生的不良反應，靜脈滴注過快可有胸悶、面部潮紅、呼吸困難等癥狀。

1.4 統(tǒng)計學處理莪術油體外抗新型冠狀病毒作用實驗運用GraphPad 7.0 Prism軟件進行ANOVA單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。莪術油注射液體內抗新型冠狀病毒作用研究采用描述性統(tǒng)計。

2 結果

2.1 莪術油體外抗新型冠狀病毒作用實驗結果分析用酶標儀檢測0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml 莪術油處理后的SARS-CoV-2類病毒細胞株(圖1)，結果顯示，隨著莪術油濃度增加，相對熒光值逐漸減弱，與0 μg/ml莪術油組比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，IC50值為0.26 μg/ml(圖2)。

圖1 不同濃度莪術油誘導SARS-CoV-2類病毒細胞后的活性與0 μg/ml莪術油組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 莪術油對SARS-CoV-2類病毒的濃度抑制曲線

2.2 莪術油注射液體內抗新型冠狀病毒作用研究結果分析

2.2.1患者入組及用藥情況 試驗擬招募患者60例，因浙江省溫州市新冠疫情得到有效控制，研究實際入組COVID-19普通型患者4例，試驗組和對照組各2例，兩組均為男性，入組時肝腎功能、生命體征均正常，其中試驗組年齡大于對照組，試驗組病例2表現(xiàn)為頻繁咳嗽，且無相關既往病史。根據(jù)患者診療進程，試驗組病例1、2分別使用莪術油注射液4天和7天。

2.2.2療效指標 研究納入的所有患者體溫、呼吸均正常，試驗組病例1糞便新型冠狀病毒核酸用藥后3 d轉陰，試驗組病例2咳嗽癥狀明顯緩解，無1例發(fā)展為重癥。對照組咽拭子轉陰時間分別為5、7 d。所有患者肺部影像學均有不同程度吸收，以試驗組病例2吸收較明顯(圖3)，3月1日左右下肺出現(xiàn)陰影，呈磨玻璃密度影，病灶里的肺間質有些增厚，3月2日患者開始接受莪術油注射液治療，3月8日復查，肺泡內滲出液逐漸被吸收，陰影減小。出院后2、4周隨訪所有患者新型冠狀病毒核酸呈陰性，血常規(guī)、肝腎功能無異常，試驗組病例2肺部影像學陰影逐漸消失，且肺間質增厚改善。

圖3 試驗組病例2肺部影像學(CT)變化A:3月1日；B:3月8日；C:3月24日

2.2.3安全性分析 在應用莪術油注射液聯(lián)合常規(guī)治療過程中，血常規(guī)、肝腎功能等實驗室檢查均未出現(xiàn)加重情況。與治療前比較，所有患者除原有的呼吸道癥狀之外，均未出現(xiàn)新的不適癥狀或加重體征情況。

3 討論

莪術油注射液具有顯著抗病毒功效(如流感病毒、呼吸道合胞病毒等)[8-10]，《浙江省抗新冠肺炎臨床診療用藥推薦目錄》推薦其為抗新冠肺炎藥物。秦宇雯 等[6]總結中藥莪術抗病毒的作用機制研究，發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制病毒 NP 蛋白，調控 PI 3 K/Akt/mTOR 信號通路，直接滅活病毒，抑制相關炎癥因子，抗肺纖維化等途徑實現(xiàn)抗 COVID-19。推測莪術可降低新冠肺炎患者炎癥水平，改善患者咳嗽、發(fā)熱、肺部啰音等體征，同時在抑制病毒復制和感染，提升機體免疫力和改善患者肺功能損傷程度等方面發(fā)揮作用，且無激素類藥物的不良反應[6-7,11-13]。

本研究從細胞水平和臨床研究兩方面探討了莪術油注射液抗新型冠狀病毒作用。通過體外制備SARS-CoV-2類病毒細胞株，用9組不同濃度莪術油進行處理，觀察和記錄細胞數(shù)及相對熒光值，計算IC50值為0.26 μg/ml(黃芪醇提取物的體外抗柯薩奇病毒效果與利巴韋林接近，其IC50值為(6.4±0.5)μg/ml，表明莪術油對SARS-CoV-2類病毒活性有較強抑制作用，且具有濃度依賴性。莪術油注射液治療COVID-19的隨機開放平行對照研究顯示，試驗組在常規(guī)治療基礎上聯(lián)用莪術油注射液，患者核酸轉陰時間縮短，可能改善SARS-CoV-2感染引起的咳嗽等癥狀，促進SARS-CoV-2轉陰及肺部病灶吸收，降低肺損傷，并且相對安全。

綜上所述，體內外研究顯示，莪術油注射液具有較強的抗新型冠狀病毒活性作用，對于COVID-19患者的救治可能具有重要的臨床價值。需要指出的是，由于項目啟動時間晚，研究立項審批通過時國內疫情已得到很好控制，實際可入組患者少，造成整體研究樣本量偏少。另外，因本研究納入患者所在病房為隔離病房，管控嚴格，入組患者詳細治療數(shù)據(jù)無法進行充分記錄，致使部分原始研究數(shù)據(jù)缺失。且入組時樣本病程已較長，故結果存在不確定性，確切的臨床療效尚需大樣本、前瞻性臨床研究進行評價，如追蹤病毒的復陽率、肺部影像學轉歸等。但基于現(xiàn)有莪術油的體內外及藥理學研究，后期可擴大莪術油注射液治療COVID-19臨床研究范圍，為莪術油等相關產(chǎn)品的開發(fā)應用和COVID-19的治療提供有力的科學依據(jù)。