李 梅，蔣錦梅，歐大明，黃麗芳，謝立虎,張 濟(jì)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥為特征的自身免疫性慢性疾病，可導(dǎo)致多關(guān)節(jié)炎癥、滑膜增生、關(guān)節(jié)破壞畸形等。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、酸脹、晨僵、活動(dòng)受限，因其較高的致畸和致殘率，給患者造成了極大的痛苦[1]。白術(shù)多糖(polysaccharide of atractylodes macrocephala koidz，PAMK)是天然中草藥白術(shù)的主要有效成分之一，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多重藥理作用[2]。有研究[3]顯示，Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)及其介導(dǎo)的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路，通過誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)炎癥因子表達(dá)，成為RA發(fā)病的關(guān)鍵。而PAMK可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[4]。推測(cè)PAMK可能會(huì)通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善RA，但PAMK在RA過程中具體作用如何，目前尚未見報(bào)道。因此，該研究擬建立RA大鼠模型，探討PAMK對(duì)RA的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量300～350 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(渝)2018-0003。于室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%環(huán)境下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求，自由飲水和攝食，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及儀器PAMK購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；雷公藤多苷片購自浙江得恩德醫(yī)藥有限公司；牛Ⅱ型膠原購自美國(guó)Chondrex公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國(guó)Sigma公司；TLR4、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)、p-NF-κB p65(Ser536)、NF-κB p65、Histone H3及β-actin抗體購自英國(guó)Abcam公司；Nuclear Extract Kit試劑盒購自美國(guó)Active Motif公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；大鼠白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物模型制備與分組 參考文獻(xiàn)[5]，采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立RA大鼠模型。具體操作如下：以醋酸為溶劑，將牛Ⅱ型膠原配制成濃度為2 mg/ml的溶液，與弗氏完全佐劑按1 ∶1混合配成乳劑Ⅰ，與弗氏不完全佐劑按1 ∶1混合配成乳劑Ⅱ。第1天于大鼠尾根部皮下注射乳劑Ⅰ，每只0.1 ml，第7天于大鼠尾根部皮下注射乳劑Ⅱ，每只0.1 ml。造模2周后，大鼠后肢足趾紅腫，踝關(guān)節(jié)體積明顯增大，提示造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組和PAMK低、高劑量組，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，每組12只。分組后陽性藥物組大鼠給予6.25 mg/kg[6]雷公藤多苷片灌胃，PAMK低、高劑量組大鼠分別按75、300 mg/kg劑量灌胃給予PAMK，正常對(duì)照組及模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。

1.3.2體質(zhì)量檢測(cè) 從第2次免疫(給藥干預(yù)第0天)開始，每隔7 d測(cè)量1次各組大鼠體質(zhì)量。

1.3.3足趾腫脹度檢測(cè) 采用水容積法，從第2次免疫(給藥干預(yù)第0天)開始，每隔7 d測(cè)量1次各組大鼠右后足容積。

1.3.4關(guān)節(jié)炎指數(shù)檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[6]，從第2次免疫(給藥干預(yù)第0天)開始，采取5級(jí)評(píng)分法，每隔7 d觀察計(jì)算1次各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)。大鼠所有關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和即為每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)值，最高計(jì)16分。

1.3.5胸腺和脾臟指數(shù)檢測(cè) 取脾臟和胸腺組織，剔除脂肪，濾紙吸干表面液體并精密稱量，分別計(jì)算其占體質(zhì)量的比例(mg /g)。

1.3.6HE染色 取踝關(guān)節(jié)滑膜組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、液體石蠟浸蠟、石蠟包埋等過程后，作連續(xù)5 μm切片，行常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.7ELISA檢測(cè) 取踝關(guān)節(jié)滑膜組織勻漿及腹主動(dòng)脈全血，于4 ℃下4 000 r/min離心10 min，分別提取上清液及血清，按照試劑盒操作說明，檢測(cè)各組大鼠血清及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.3.8Western blot檢測(cè) 取踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用RIPA裂解液提取總蛋白、Nuclear Extract Kit試劑盒提取核蛋白，通過BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，取20 μg總蛋白或核蛋白與上樣緩沖液均勻混合，隨后SDS-PAGE電泳并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入TLR4抗體(兔抗，1 ∶1 000)、MyD88抗體(兔抗，1 ∶1 000)、p-NF-κB p65抗體(兔抗，1 ∶1 000)、NF-κB p65抗體(兔抗，1 ∶1 000)、Histone H3抗體(兔抗，1 ∶1 000)、β-actin抗體(兔抗，1 ∶1 000)一抗，搖床孵育過夜；然后加入二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h后ECL顯色，以Histone H3、β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)參，應(yīng)用Image J進(jìn)行灰度分析，分析總蛋白TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及核蛋白NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)；與模型組比較，治療1周后陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠體質(zhì)量升高(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠足趾腫脹度比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠足趾腫脹度升高(P<0.05)；與模型組比較，治療1周后陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠足趾腫脹度降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，治療1周后陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較分，n=12)

2.4 各組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)比較

2.5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化如圖1所示，正常對(duì)照組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)正常，表面光滑無增生；模型組、PAMK低劑量組大鼠滑膜組織增生，層次不清，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；陽性藥物組、PAMK高劑量組滑膜組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。

圖1 踝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色 ×400A:正常對(duì)照組；B：模型組；C：陽性藥物組；D：PAMK低劑量組；E：PAMK高劑量組

2.6 各組大鼠血清及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠血清及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組血清及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

2.7 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表6。

圖2 Western blot檢測(cè)各組心肌組織中TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達(dá)A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：陽性藥物組；D：PAMK低劑量組；E：PAMK高劑量組

表6 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

自身免疫激活是RA發(fā)病的關(guān)鍵，隨后的炎癥因子大量釋放，導(dǎo)致滑膜炎癥發(fā)生。蒼術(shù)屬植物種類繁多，白術(shù)是其中之一，在中國(guó)藥典中白術(shù)和蒼術(shù)有著明確的區(qū)分，但在日本部分品種的蒼術(shù)也被當(dāng)做白術(shù)使用。有學(xué)者研究了包括白術(shù)在內(nèi)的五種蒼術(shù)屬植物在RA中的作用，發(fā)現(xiàn)這些植物均可有效降低RA大鼠血清中炎癥因子水平，從而改善RA[7]。但其研究?jī)H限于白術(shù)復(fù)合物，并非單體物質(zhì)，復(fù)合物的藥理成分復(fù)雜，穩(wěn)定性差，而PAMK作為白術(shù)中起主要作用的單體物質(zhì)，成分單一，穩(wěn)定性更好。因此，本研究進(jìn)一步探索了PAMK對(duì)RA的抗炎作用及可能機(jī)制。

本研究通過Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立RA大鼠模型后，模型組大鼠精神倦怠，食欲減退，四肢出現(xiàn)明顯紅腫及變形，體質(zhì)量較正常對(duì)照組大鼠顯著降低，足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高，且踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生，病理學(xué)改變明顯，以上提示RA大鼠造模成功。經(jīng)PAMK治療后，大鼠體質(zhì)量較模型組顯著升高，足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低，且踝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)趨于正常，說明PAMK可保護(hù)RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，對(duì)RA有改善作用。

脾臟和胸腺是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可以在一定程度上反映機(jī)體免疫水平的高低及狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)較正常對(duì)照組顯著升高，標(biāo)志著RA大鼠免疫系統(tǒng)的激活，局部抗原發(fā)生改變，在滑膜組織中炎癥因子大量釋放，導(dǎo)致滑膜炎癥的發(fā)生[8]。IL-1β是一種破骨細(xì)胞激活因子，它常與TNF-α同時(shí)合成和分泌，共同破壞關(guān)節(jié)軟骨，造成關(guān)節(jié)損傷[9]。IL-6是一種重要的促炎因子，參與多種人體炎癥反應(yīng)和疾病，同時(shí)還能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化[10]。IL-1β、IL-6和TNF-α刺激著軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞分泌膠原酶等物質(zhì)，破壞軟骨細(xì)胞周圍環(huán)境，是RA過程中起主要作用的炎性介質(zhì)[11]。本研究顯示，模型組大鼠血清及踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平較正常對(duì)照組顯著升高，經(jīng)PAMK治療后，大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，且胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低，說明PAMK可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫水平，從而減輕RA大鼠炎癥反應(yīng)。

MyD88是TLR4/NF-κB信號(hào)通路中重要的接頭蛋白分子，可以通過傳導(dǎo)信號(hào)激活下游多種轉(zhuǎn)錄因子。TLR是非特異性免疫反應(yīng)中的重要的蛋白質(zhì)分子，能夠通過識(shí)別脂多糖、膜脂蛋白等分子參與機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)[12]。其中TLR4是關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)蛋白之一，可以通過與相應(yīng)配體結(jié)合活化NF-κB，啟動(dòng)和調(diào)控炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，在RA過程中發(fā)揮重要作用[13]。NF-κB由p65和p50兩個(gè)亞基組成，通常情況下與其抑制性蛋白IκB結(jié)合而呈非活化狀態(tài)，受到刺激后，NF-κB p65磷酸化使IκB降解，導(dǎo)致NF-κB入核并活化，從而刺激炎癥因子的釋放，加重炎癥損傷[14]。本研究顯示，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高，標(biāo)志著TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，經(jīng)PAMK治療后，大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明PAMK減輕RA大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)，可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，PAMK可以通過減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，起到對(duì)RA大鼠的治療和保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化實(shí)現(xiàn)的，為RA的臨床治療提供了新的參考依據(jù)。