王坤男，張錦明，張 蕓，張鈞則，袁新普，鄒貴軍，張朝軍

在全球范圍內(nèi)，胃癌是消化系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一[1]。在我國其發(fā)病率居第二位，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的重要因素[2]。隨著醫(yī)學(xué)水平不斷發(fā)展已在一定程度上改善了胃癌患者預(yù)后，但晚期胃癌患者尚無有效治療手段，中位生存期不到12個月[3-4]。因此，探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制對胃癌防治至關(guān)重要。

microRNA是真核生物中抑制基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤生長等生物學(xué)功能[5]。有研究[6]證實大多數(shù)癌癥中存在miRNA異常表達(dá)。相關(guān)研究[7-10]提示miR-3188在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。該研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-3188的下游靶基因，通過使用基因干擾技術(shù)，觀察miR-3188通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的影響，為探究胃癌進(jìn)展機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞、胃黏膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司，胃癌細(xì)胞系MGC-803細(xì)胞購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，BGC-823細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞獲贈于陸軍軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)材料學(xué)教研室。DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液購自索萊寶科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒及TRIzol試劑均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit、定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM、microRNA提取試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green? qRT-PCR User Manual購自Takara公司；miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、陰性對照以及pc-control、pc-NRAGE質(zhì)粒均由蘇州吉瑪生物科技有限公司提供，含野生型和突變型NRAGE序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供；細(xì)胞周期蛋白D 1(CyclinD 1)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP 9)，B-cell leuke-2蛋白(Bcl-2)，N鈣黏蛋白(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，E鈣黏蛋白(E-cadherin)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗及電化學(xué)發(fā)光(ECL)液購自江蘇親科生物研究中心有限公司；NRAGE抗體購自Abcam公司，雙熒光素酶檢測報告試劑盒購自美國Progema公司；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司；RIPA、BCA蛋白定量試劑盒等蛋白免疫印跡實驗所需試劑均購自北京陽光英銳生物有限公司；CCK-8試劑盒購自北仁化學(xué)科技(北京)有限公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Miltenyi Biotec公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組細(xì)胞系HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45及GES-1放入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度到80%左右時進(jìn)行傳代。將HGC-27細(xì)胞分為陰性對照組(miR-NC組、antimiR-NC組)：轉(zhuǎn)染對照模擬物、對照抑制物；miR-3188上調(diào)組(miR-3188組)：轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic；miR-3188下調(diào)組(antimiR-3188組)：轉(zhuǎn)染miR-3188 inhibitor；miR-3188+pc-control組：共同轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic與陰性對照質(zhì)粒；miR-3188+pc-NRAGE組：共同轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic與NRAGE過表達(dá)質(zhì)粒。將miRNA模擬物NC(miR-NC)、miRNA抑制物NC(antimiR-NC)、miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、陰性對照質(zhì)粒(pc-control)、NRAGE過表達(dá)質(zhì)粒(pc-NRAGE)分別或共同轉(zhuǎn)染至HGC-27細(xì)胞中，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作,首先將細(xì)胞均勻接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合度至40%左右時，使用LipofectamineTM2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48～72 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-3188及NRAGE mRNA表達(dá)水平采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green? qRT-PCR User Manual說明書進(jìn)行qRT-PCR檢測。miR-3188以U6為內(nèi)參基因，NRAGE以GAPDH為內(nèi)參基因，用公式2-ΔΔCt計算miR-3188和NRAGE mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 生物信息學(xué)分析使用基因預(yù)測網(wǎng)站Tar-getScan(www.targetscan.org)預(yù)測miR-3188的下游靶基因，從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.

nih.gov)下載胃癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)并分析miR-3188與所預(yù)測靶基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 雙熒光素酶報告實驗利用生物信息分析數(shù)據(jù)庫(TargetScan)預(yù)測NRAGE mRNA的3′UTR存在miR-3188的結(jié)合位點，分別構(gòu)建重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-NRAGE-3′UTR(WT-NRAGE)及突變熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-NRAGE-3′UTR(MUT-NRAGE)，按照轉(zhuǎn)染試劑說明將WT-NRAGE和MUT-NRAGE轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，同時將miR-control或miR-3188 mimic轉(zhuǎn)入各組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后按照熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HGC-27細(xì)胞中NRAGE、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液，經(jīng)12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，測定蛋白濃度后各蛋白樣品分別加入5倍上樣緩沖液，金屬浴變性5 min。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳實驗(80 V 20 min；120 V 90 min)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜剪裁為合適大小，室溫下用5% 脫脂奶粉封閉2 h，加入各蛋白一抗(除GAPDH稀釋比例為1 ∶5 000外，其余蛋白一抗稀釋比例均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，5 min/次，加入二抗(稀釋比例1 ∶8 000)于室溫條件下孵育1 h，TBST洗滌3次，5 min/次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行曝光拍照。

1.7 CCK-8法檢測HGC-27細(xì)胞增殖率將各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后重新調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/ml，以5 000個/孔的密度將細(xì)胞接種至96孔板內(nèi),每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度(optical density，OD)值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌、胰蛋白酶消化后重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，收集細(xì)胞后加入1 ml 1×binding Buffer洗滌兩次后，加入5 μl Annexin V-FITC混勻、室溫下避光孵育15 min，使用1 ml 1×Binding Buffer洗滌細(xì)胞，重懸細(xì)胞加入5 μl PI后使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.9 Transwell實驗檢測HGC-27細(xì)胞侵襲和遷移能力預(yù)備：將基質(zhì)膠至于4 ℃冰箱內(nèi)過夜解凍，次日使用無血清DMEM培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋至30 mg/ml，取100 μl稀釋液置于Transwell小室上室；細(xì)胞處理：收集各組處于對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/ml，取100 μl細(xì)胞懸液置于鋪滿基質(zhì)膠的Transwell小室的上室；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后用沾有PBS的棉簽除去基質(zhì)膠及Transwell小室的上室細(xì)胞，用多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫溶液染色20 min，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)。細(xì)胞遷移實驗：除去制備基質(zhì)膠實驗步驟外，其余實驗步驟均與細(xì)胞侵襲實驗相同。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及制圖。本研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，雙連續(xù)變量相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。當(dāng)P<0.05時，說明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃黏膜細(xì)胞及胃癌細(xì)胞中miR-3188的表達(dá)水平qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，miR-3188在 HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45 中的相對表達(dá)量低于 GES-1，其中 HGC-27 細(xì)胞中 miR-3188 相對表達(dá)量最低，選擇 HGC-27 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗，胃黏膜膜細(xì)胞同胃癌細(xì)胞系中的miR-3188相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=362，P<0.001)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測正常胃黏膜細(xì)胞及胃癌細(xì)胞系中miR-3188表達(dá)與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1比較：***P<0.001

2.2 miR-3188靶向調(diào)控胃癌細(xì)胞中NRAGE的表達(dá)生物信息分析數(shù)據(jù)庫(TargetScan)預(yù)測NRAGE可能是miR-3188的靶基因，使用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，Spearman相關(guān)分析提示在胃癌中NRAGE的表達(dá)量與miR-3188表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(rho=-0.22，P<0.05)，見圖2A。雙熒光素酶報告實驗顯示，在WT-NRAGE轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，與miR-control轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比較，miR-3188 mimic 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.791，P<0.01)，共轉(zhuǎn)染MUT-NRAGE與miR-3188 mimic的細(xì)胞熒光素酶活性未見改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.388，P>0.05)，見圖2B。Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor及其陰性對照物miR-NC、antimiR-NC的HGC-27細(xì)胞中NRAGE蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic的HGC-27細(xì)胞中miR-3188組NRAGE蛋白表達(dá)水平低于miR-NC組，而轉(zhuǎn)染miR-3188 inhibitor的HGC-27細(xì)胞中antimiR-3188組NRAGE蛋白表達(dá)水平高于antimiR-NC組。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，各組NRAGE mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.08，P>0.05)，見圖3。

圖2 miR-3188在HGC-27細(xì)胞中與NRAGE 3的靶向關(guān)系A(chǔ)：生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-3188與NRAGE 3′UTR的結(jié)合位點及在胃癌組織中miR-3188與NRAGE表達(dá)水平的相關(guān)性；B：雙熒光素酶報告實驗驗證miR-3188的靶基因；與WT-NRAGE+miR-control比較：**P<0.01

圖3 miR-3188對HGC-27細(xì)胞NRAGE蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響A：miR-NC組；B：miR-3188組；C：antimiR-NC組；D:antimiR-3188組

2.3 miR-3188通過調(diào)控NRAGE表達(dá)抑制HGC-27細(xì)胞增殖CCK-8實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h時，同miR-NC組相比，miR-3188組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.504，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE組的細(xì)胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.630，P<0.001)；轉(zhuǎn)染72 h時，同miR-NC組相比，miR-3188 mimic組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.301，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE組的細(xì)胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.125，P<0.001)，見圖4。

圖4 miR-3188靶向NRAGE對HGC-27細(xì)胞增殖的影響與miR-NC組比較：***P<0.001；與miR-3188+pc-control組比較：###P<0.001；A:miR-NC組；B:miR-3188組；C:miR-3188+pc-control組；D:miR-3188+pc-NRAGE組

2.4 miR-3188通過調(diào)控NRAGE表達(dá)促進(jìn)HGC-27細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果提示，同miR-NC組相比，miR-3188組的細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.735，P<0.001)，而miR-3188+pc-NRAGE組細(xì)胞凋亡率低于miR-3188+pc-control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.96，P<0.01)，見圖5。

圖5 miR-3188靶向NRAGE對HGC-27細(xì)胞凋亡的影響A：流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率變化；B：與miR-NC組比較：***P<0.001；與miR-3188+pc-control組比較：##P<0.01；a：miR-NC組；b：miR-3188組；c：miR-3188+pc-control組；d：miR-3188+pc-NRAGE組

2.5 miR-3188通過調(diào)控NRAGE表達(dá)抑制HGC-27細(xì)胞侵襲及遷移能力Transwell實驗結(jié)果提示，同miR-NC組相比，miR-3188組各視野下的細(xì)胞侵襲數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.760，P<0.01)，各視野下的細(xì)胞遷移數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.590，P<0.01)；同miR-3188+pc-control相比，miR-3188+pc-NRAGE組各視野下細(xì)胞侵襲數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.151，P<0.01)，各視野下細(xì)胞遷移數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.361，P<0.01)，見圖6。

圖6 miR-3188靶向NRAGE對HGC-27細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 ×200與miR-NC組比較：**P<0.01；與miR-3188+pc-control組比較：##P<0.01

2.6 miR-3188通過調(diào)控NRAGE表達(dá)抑制HGC-27細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，miR-3188組的N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9蛋白表達(dá)水平低于miR-NC組，而miR-3188+pc-NRAGE組N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9的表達(dá)水平高于miR-3188+pc-control組，同時miR-3188組E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于miR-NC組，而miR-3188+pc-NRAGE組E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于miR-3188 mimic+pc-control組，見圖7。

圖7 miR-3188靶向調(diào)控NRAGE對HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響A：miR-NC組；B：miR-3188組；C：miR-3188+pc-control組；D：miR-3188+pc-NRAGE組

3 討論

胃癌是當(dāng)前威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤之一，探索胃癌的發(fā)病機制及尋找潛在治療靶點仍是需要解決的重要難題。大量研究已經(jīng)證實miRNA在眾多癌癥當(dāng)中存在異常表達(dá)，其在癌癥的診斷及治療方面的價值不言而喻，同時越來越多的研究亦表明miRNA密切參與調(diào)控胃癌的發(fā)展過程。例如，miR-505可通過靶向調(diào)控HMGB 1抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡[11]。相反，miR-532可靶向調(diào)控NKD 1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[12]。miRNA在胃癌發(fā)展過程中可扮演多種角色并發(fā)揮重要作用，因此研究miRNA對胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響對探索胃癌發(fā)病機制及發(fā)展過程具有重要意義。

有研究[7]證實miR-3188在不同癌癥當(dāng)中發(fā)揮重要作用，例如在鼻咽癌中，miR-3188可作為腫瘤抑制因子直接靶向mTOR參與FOXO 1介導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制，腫瘤發(fā)生和鼻咽癌化療耐藥。miR-3188在頭頸部癌(HNC)細(xì)胞系、組織來源的外泌體及其親本癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)中低表達(dá)，外泌體內(nèi)的miR-3188可通過靶向Bcl-2影響HNC細(xì)胞的增殖和凋亡[8]。miR-3188在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞中通過mTOR/PI3K/AKT/c-jun信號通路與FOXO 1相互作用從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖[9]。相反，miR-3188在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可通過抑制p 27促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[10]。本研究結(jié)果顯示miR-3188在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量低于正常胃黏膜細(xì)胞，通過在胃癌細(xì)胞HGC-27中轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic，并進(jìn)行CCK-8實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實驗，實驗結(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞HGC-27中過表達(dá)miR-3188能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)其發(fā)生凋亡，miR-3188可能在胃癌發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。

本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測NRAGE可能是miR-3188的靶基因，有研究[13]表明，在胃癌組織中NRAGE表達(dá)上調(diào)與TNM分期、局部浸潤和預(yù)后不良相關(guān)。此外，熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，在WT-NRAGE轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，miR-3188過表達(dá)降低熒光素酶活性，而在MUT-NRAGE轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，則未見熒光素酶活性降低，該結(jié)果顯示NRAGE是miR-3188的靶基因。通過在胃癌細(xì)胞HGC-27中分別轉(zhuǎn)染miR-3188 mimic及miR-3188 inhibitor，Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示miR-3188可負(fù)向調(diào)控NRAGE蛋白表達(dá)，但不影響其mRNA表達(dá)水平。為進(jìn)一步探究胃癌細(xì)胞中miR-3188是否通過調(diào)控NRAGE發(fā)揮抑癌作用，將pc-control及pc-NRAGE分別轉(zhuǎn)染至miR-3188過表達(dá)的HGC-27細(xì)胞中，CCK-8實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pc-NRAGE可逆轉(zhuǎn)miR-3188對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、侵襲及遷移能力的抑制作用，并減少細(xì)胞凋亡。CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9分別是細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移生物學(xué)行為的重要標(biāo)志蛋白[14-15]。Western blot結(jié)果提示miR-3188/NRAGE軸可能通過干擾上述蛋白表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞發(fā)展。EMT機制在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等蛋白是EMT的標(biāo)志蛋白[15]。本研究結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞HGC-27中miR-3188過表達(dá)可通過抑制NRAGE表達(dá)導(dǎo)致N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)同時促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)。這一結(jié)果提示在胃癌細(xì)胞HGC-27中，miR-3188可能通過靶向調(diào)控NRAGE抑制EMT進(jìn)程。

綜上所述，miR-3188過表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的生長，其作用機制可能與通過靶向調(diào)控NRAGE的表達(dá)有關(guān)，該研究結(jié)果為探索胃癌發(fā)展機制及找尋新的胃癌治療靶點提供了實驗依據(jù)。