朱延?xùn)|，李 艷，周曉燕

糖尿病伴隨抑郁癥是身體/精神共病的典型病例，糖尿病患者伴抑郁癥的發(fā)病率是非糖尿病患者的兩倍[1]。目前臨床上多應(yīng)用抗抑郁藥和降糖藥來(lái)治療糖尿病患者的抑郁樣癥狀，但是效果不明顯且副作用大[2]。因此，尋找有效的治療糖尿病抑郁的藥物尤為重要。海馬是調(diào)控情緒和認(rèn)知的功能腦區(qū)，海馬區(qū)炎癥和神經(jīng)元損傷與糖尿病抑郁發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)是糖尿病多種并發(fā)癥的關(guān)鍵因子。海馬區(qū)RAGE表達(dá)顯著增加，激活其相關(guān)信號(hào)通路，損傷海馬神經(jīng)元突觸傳遞，是焦慮和抑郁等精神行為異常的關(guān)鍵因素[4-5]。該研究通過(guò)腹腔注射RAGE抑制劑FPS-ZM1，觀察其對(duì)2型糖尿病模型鼠db/db小鼠抑郁樣行為，海馬神經(jīng)元凋亡和NOD樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3, NLRP3)炎性小體的影響，明確FPS-ZM1對(duì)db/db小鼠抑郁行為的影響及分子機(jī)制，能夠?yàn)橹委熖悄虿∫钟舭Y狀提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 TUNEL試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司(貨號(hào)：KGA703)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(貨號(hào)：P0010S)和免疫印跡制膠試劑盒(貨號(hào)：P0012A)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RAGE抗體(貨號(hào): SC-365154)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；NLRP3抗體(貨號(hào): NBP2-12446)購(gòu)自美國(guó)Novus公司；白介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)抗體(貨號(hào): 16806-1-AP)和半胱氨酸蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, Caspase-1) 抗體(貨號(hào): 22915-1-AP)均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。其他化學(xué)試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥試劑有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5～7 周齡2型糖尿病模型小鼠db/db及對(duì)照雜合子db/m 小鼠均購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，并于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌飼料和無(wú)菌水喂養(yǎng)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 6～8周齡雄性db/db小鼠24只，隨機(jī)分為2型糖尿病組(db/db，不予任何處理)、糖尿病給藥組[db/db+FPS，db/db小鼠腹腔注射FPS-ZM1 1.0 mg/(kg·d)]、糖尿病溶劑對(duì)照組(db/db+Oil，db/db小鼠腹腔注射同等體積的玉米油)，每組8只。6～8周齡的雄性db/m小鼠8只作為正常對(duì)照。給藥12周后，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，然后處死取腦。

1.2.2懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test, TST)[6]將小鼠尾部懸掛于離地面40 cm的實(shí)驗(yàn)桿上，2 min適應(yīng)后，Any Maze軟件系統(tǒng)攝像頭追蹤小鼠頭部，記錄4 min內(nèi)小鼠不動(dòng)時(shí)間。

1.2.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test, FST)[7]將直徑45 cm、19 cm的玻璃容器內(nèi)盛水，水溫22～25°C，液面高度23 cm。將小鼠放入容器中適應(yīng)2 min后，Any Maze軟件系統(tǒng)攝像頭追蹤小鼠頭部，記錄 4 min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間。

1.2.4海馬蛋白的提取和濃度測(cè)定 1.5%的戊巴比妥(0.6 ml/g)腹腔注射麻醉小鼠，每組4只小鼠，然后迅速斷頭取腦，剝離出小鼠雙側(cè)海馬放于EP管中。按照胞質(zhì)蛋白提取試劑盒加入600 μl的勻漿液，冰上勻漿后，12 000 r/min，離心10 min，吸取上清液，即為胞質(zhì)蛋白。然后使用BSA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定。根據(jù)所測(cè)各樣本濃度，取相同的樣本量，補(bǔ)充勻漿液至相同的體積。加入4 × Loading buffer，充分混勻后沸水煮10 min，使蛋白完全變性，放入-20 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.2.5海馬腦片準(zhǔn)備和TUNEL染色 將每組4只小鼠麻醉后，用4%的多聚甲醛灌注 20 min后，取腦剝離后固定，脫水透明后修剪腦塊并進(jìn)行石蠟包埋。腦片冠狀縫切片，厚度5 μm，脫蠟至水后按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行染色。首先滴加proteinase K工作液37 ℃反應(yīng)30 min，PBS漂洗3次，每個(gè)腦片加入50 μl標(biāo)記液(TdT和dUTP混合液)，室溫30 min后加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃避光反應(yīng)1 h。PBS常規(guī)漂洗3次，滴加50 μl DAB工作液反應(yīng)5 min，PBS漂洗3次后復(fù)染封片。Olympus DP73正置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，凋亡神經(jīng)元著色較深，體積變小，細(xì)胞核皺縮或溶解，細(xì)胞質(zhì)染色質(zhì)分割成塊狀或出現(xiàn)點(diǎn)狀的凋亡小體。計(jì)數(shù)小鼠海馬CA3區(qū)1 mm2面積中神經(jīng)元的凋亡率。

1.2.6免疫印跡法檢測(cè)RAGE、NLRP3、IL-1β、Caspase-1以及Actin的表達(dá) 根據(jù)蛋白的分子量配置10%(RAGE、IL-1β及Caspase-1)和8%(NLRP3)的電泳凝膠。每孔上樣10～20 μl(含蛋白量40～80 μg)，常規(guī)電泳和電轉(zhuǎn)。NC膜在3% BSA中封閉3 h后，浸泡在合適比例的一抗(RAGE：1 ∶3 000；NLRP3：1 ∶3 000；IL-1β：1 ∶2 000；Caspase-1：1 ∶2 000)中，4 ℃孵育過(guò)夜。次日Washing Buffer震蕩洗滌5次后，熒光二抗(1 ∶3 000)室溫?fù)u床孵育1 h后，Odyssey化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)掃描條帶。使用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析，計(jì)算各組目的蛋白與Actin灰度值的比值，再將各組獲得的比值與對(duì)照組(db/m)相比作為各組的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RAGE抑制劑FPS-ZM1改善db/db小鼠抑郁樣行為FPS-ZM1注射12周后，應(yīng)用TST和FST檢測(cè)小鼠抑郁癥狀。結(jié)果顯示：db/db小鼠在TST和FST中的不動(dòng)時(shí)間(95.25 ± 8.4，103.40 ± 7.9)顯著高于db/m小鼠(57.10 ± 5.8，67.13 ± 6.6)(F=22.52、15.16 ，P<0.01)；FPS-ZM1能減少db/db小鼠在TST和FST中的不動(dòng)時(shí)間 (76.27 ± 7.2，82.26 ± 7.7)(F=22.52、15.16，P<0.01)。表明FPS-ZM1能改善糖尿病小鼠的抑郁樣行為。見(jiàn)圖1。

圖1 FPS-ZM1改善db/db小鼠的抑郁樣癥狀(n=8)與db/m組比較：** P<0.01；與db/db組比較：## P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

2.2 RAGE抑制劑FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬神經(jīng)元凋亡應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)元的凋亡率，結(jié)果顯示：db/db小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡率高于db/m組(F=80.93，P<0.01)；應(yīng)用FPS-ZM1后降低db/db小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡(F=80.93，P<0.01)。表明FPS-ZM1能減少高血糖引起的海馬神經(jīng)元凋亡。見(jiàn)圖2。

圖2 FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬神經(jīng)元凋亡(n=8)A：海馬切片TUNEL染色的典型圖片；e-h：a-d中的黑框區(qū)域放大圖；a-d：×40；e-h：×400；紅色箭頭：凋亡細(xì)胞；B：海馬CA3細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)圖；與db/m組比較：*P<0.05, **P<0.01；與db/db組比較：## P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

2.3 RAGE抑制劑FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬區(qū)RAGE和NLRP3的表達(dá)免疫印跡結(jié)果顯示：db/db小鼠海馬區(qū)RAGE的表達(dá)增加(F=24.02，P<0.01)，而FPS-ZM1能夠降低db/db小鼠海馬區(qū)RAGE的高表達(dá)(F=24.02，P<0.01)。db/db小鼠海馬區(qū)NLRP3的表達(dá)增加(F=28.14，P<0.01)，而FPS-ZM1能夠降低db/db小鼠海馬區(qū)NLRP3的表達(dá)(F=28.14，P<0.01)。表明FPS-ZM1能下調(diào)高血糖引起的RAGE高表達(dá)以及其下游炎性小體的活化。見(jiàn)圖3。

圖3 FPS-ZM1抑制db/db小鼠海馬中RAGE和NLRP3的水平(n=4)A、B：免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAGE、NLRP3的表達(dá)；C：各組RAGE和NLRP3相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)圖；與db/m組比較：*P<0.05, ** P<0.01；與db/db組比較：## P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

2.4 RAGE抑制劑FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬區(qū)Caspase-1和IL-1β的活化免疫印跡結(jié)果顯示：db/db小鼠海馬區(qū)IL-1β的表達(dá)高于db/m小鼠(F=27.06，P<0.01)，而FPS-ZM1能降低高血糖引起的IL-1β高表達(dá)(F=27.06，P<0.01)，而db/m組、db/db組、db/db+FPS組以及db/db+Oil組中IL-1β的前體蛋白pro-IL-1β的表達(dá)沒(méi)有差異；db/db小鼠海馬區(qū)Caspase-1的表達(dá)高于db/m小鼠(F=193.90，P<0.01)，同樣，F(xiàn)PS-ZM1能降低Caspase-1的高表達(dá)(F=193.90，P<0.01)，而Caspase-1的前體蛋白pro-Caspase-1的表達(dá)各組間無(wú)明顯差異。表明FPS-ZM1能抑制高血糖引起的NLRP3炎性小體的活化。見(jiàn)圖4。

圖4 FPS-ZM1降低db/db小鼠海馬區(qū)Caspase-1和IL-1β的表達(dá)(n=4)A、B：免疫印跡法檢測(cè)Caspase-1、IL-1β的表達(dá)水平；C：Caspase-1和IL-1β的相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)圖；與db/m組比較：*P<0.05, ** P<0.01；與db/db組比較：##P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

3 討論

糖尿病和抑郁共病會(huì)導(dǎo)致患者生活質(zhì)量顯著降低，同時(shí)也給糖尿病患者的家庭以及全社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前關(guān)于糖尿病引起抑郁癥狀發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全闡明，臨床尚缺乏有效的治療措施。因此，深入探討糖尿病引起抑郁行為的分子機(jī)制，能夠?yàn)檠邪l(fā)治療糖尿病抑郁的藥物提供可靠治療靶標(biāo)。研究[8]顯示海馬CA3區(qū)是調(diào)控情緒的關(guān)鍵功能腦區(qū)，CA3區(qū)神經(jīng)元的損傷和神經(jīng)突觸連接障礙是抑郁發(fā)生發(fā)展的重要原因。此外，高血糖引起的腦內(nèi)炎癥因子表達(dá)增加，也在糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥以及精神行為異常中扮演著重要角色。炎癥反應(yīng)引起海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活，介導(dǎo)凋亡啟動(dòng)子Caspase-3的活化，進(jìn)而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷，引起糖尿病小鼠認(rèn)知障礙、焦慮、抑郁等精神行為異常[9-10]。

NLRP3炎性小體是由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)以及Caspase-1前體蛋白(Pro-caspase-1)共同組成的一個(gè)炎性復(fù)合體。該炎性小體活化后可引起Pro-caspase-1剪切活化成Caspase-1，進(jìn)而使IL-1β前體也發(fā)生剪切，形成有活性的IL-1β。Caspase-1和IL-1β活化后從胞質(zhì)釋放到胞外，引起局部的炎癥反應(yīng)[11-12]。既往的研究[13]顯示，高血糖可活化小鼠海馬區(qū)NLRP3，導(dǎo)致Caspase-1和IL-1β等下游炎癥介質(zhì)釋放增加，進(jìn)而通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)糖尿病小鼠認(rèn)知障礙、行為異常和抑郁樣癥狀。敲除NLRP3或抑制NLRP3炎性小體的活化，都能夠減輕神經(jīng)炎癥，改善高血糖引起的行為異常和抑郁樣癥狀。

研究[14]證實(shí)，高糖刺激引起海馬區(qū)RAGE表達(dá)顯著增加。RAGE作為上游信號(hào)分子，可通過(guò)激活NLRP3炎性小體和其他凋亡信號(hào)通路，引起海馬神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致神經(jīng)突觸連接障礙。因此RAGE是糖尿病神經(jīng)抑郁及其他神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。敲除RAGE，能夠抑制糖尿病小鼠海馬區(qū)絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路，改善海馬神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)，提高糖尿病小鼠的認(rèn)知功能[15]。此外應(yīng)用RAGE特異性抑制劑FPS-ZM1能顯著抑制高糖環(huán)境中RAGE的表達(dá)，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低糖尿病小鼠海馬神經(jīng)元損傷，提高神經(jīng)纖維的密度，改善海馬依賴性的空間學(xué)習(xí)記憶能力[5]。因此RAGE與糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥密切相關(guān)，其抑制劑FPS-ZM1能夠減輕高糖刺激引起的海馬神經(jīng)元損傷。但是FPS-ZM1是否能夠改善糖尿病抑郁，以及其減輕抑郁的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探明。

本研究以2型糖尿病模型鼠db/db小鼠為糖尿病-抑郁共病模型，應(yīng)用行為學(xué)、組化和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，闡明了RAGE抑制劑FPS-ZM1改善糖尿病抑郁的分子機(jī)制：FPS-ZM1通過(guò)下調(diào)海馬區(qū)RAGE的表達(dá)，減少其下游NLRP3炎性小體的活化，進(jìn)而抑制高血糖引起的海馬神經(jīng)元凋亡，減輕糖尿病小鼠抑郁。該分子機(jī)制的闡明對(duì)研發(fā)治療糖尿病抑郁的藥物提供了可靠的理論依據(jù)。