王文博，榮 毅，陳 玲，李新芝，司軍強(qiáng)，王 麗，馬克濤

心力衰竭的病理進(jìn)程往往伴隨著交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活和血漿兒茶酚胺水平的增高。在急性交感應(yīng)激時，心臟中的α1-腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor，α1-AR)、β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptor，β-AR)被兒茶酚胺激活，并通過NLRP3炎性小體/半胱天冬氨酸蛋白酶-1/白細(xì)胞介素18(interleukin-18，IL-18)通路(NLRP3/Caspase-1/IL-18)介導(dǎo)急性交感應(yīng)激引起的心臟炎癥[1]。而炎性小體(NACHT、LRR和PYD結(jié)構(gòu)域蛋白、NLRP)作為一種大分子蛋白質(zhì)復(fù)合物，可精細(xì)調(diào)節(jié)Caspase-1的激活以及促炎性細(xì)胞因子[如白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18]的產(chǎn)生和分泌，其核心作用已被眾多研究證實[2]。

縫隙連接蛋白廣泛分布在人體中，這些跨膜蛋白組裝形成稱為間隙連接的細(xì)胞間通道[3]。縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是心臟中連接蛋白最豐富的同工型，主要存在于心室肌細(xì)胞中，對維持由心肌細(xì)胞的協(xié)調(diào)收縮引起的正常心跳至關(guān)重要[4]。有研究[5]表明，α腎上腺素能受體激動劑苯腎上腺素(phenylephrine，PE)可增強(qiáng)新生大鼠心肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)，從而導(dǎo)致縫隙連接電導(dǎo)的增強(qiáng)。然而，在心臟急性交感應(yīng)激中，Cx43的作用目前尚未見相關(guān)報道。該研究將在心肌細(xì)胞水平，通過急性過度激活α1-AR模擬誘導(dǎo)心臟急性交感應(yīng)激疾病模型，探討Cx43在心臟急性交感應(yīng)激中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2大鼠心肌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。PE購于 Sigma 公司；Cx43特異性阻斷劑Gap26 購于APExBIO 公司；兔抗 NLRP3抗體、兔抗 Cx43抗體、鼠抗IL-1β抗體購于Abcam 公司；兔抗Caspase-1抗體、兔抗IL-18抗體購于Proteintech Group公司；小鼠抗 GAPDH 抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其余試劑材料均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1H9C2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組 使用含有12%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)DMEM培養(yǎng)基，將H9C2心肌細(xì)胞置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%時進(jìn)行傳代及下一步實驗。首先使用50 μmol/L PE分別干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞5、15、30、60、120 min，檢測不同時間組心肌細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)，確定PE干預(yù)時間。接下來實驗分為4組：對照組(control組)、PE單獨處理組、Gap26 干預(yù)組、Gap26單獨處理組，其中PE單獨處理組中PE干預(yù)濃度為50 μmol/L[6-7]，Gap26干預(yù)組給予0.5 μmol/L的Gap26預(yù)處理30 min后[8]，加入50 μmol/L的PE干預(yù)15 min。

1.2.2Western blot法檢測H9C2大鼠心肌細(xì)胞Cx43、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白水平 從心肌細(xì)胞中提取蛋白樣品，用10%或12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h(5%的脫脂奶粉或BSA)。分別加小鼠抗GAPDH抗體(1 ∶ 1 000) 、兔抗Cx43抗體(1 ∶1 000) 、兔抗NLRP3抗體(1 ∶1 000)、兔抗Caspase-1抗體(1 ∶1 000)、鼠抗IL-1β抗體(1 ∶500)、兔抗IL-18抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后孵育二抗(1 ∶5 000、1 ∶10 000)2 h；洗膜后在暗室內(nèi)加ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影，壓片、曝光。使用Image J軟件對目的蛋白進(jìn)行灰度值分析。

1.2.3免疫熒光法檢測H9C2大鼠心肌細(xì)胞Cx43的蛋白表達(dá)及定位 將H9C2大鼠心肌細(xì)胞按分組接種于小皿中，爬片，恒溫培養(yǎng)。待爬片上心肌細(xì)胞形態(tài)良好、密度適中時，分組干預(yù)后棄培養(yǎng)基，預(yù)溫PBS清洗3次，后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次；用0.2% Triton X-100將各皿細(xì)胞透化破膜3～5 min；PBS清洗3次，加5% BSA置于37 ℃溫箱中封閉30 min；棄掉封閉液后，加入兔抗Cx43(1 ∶100)，于濕盒中4 ℃孵育過夜；次日，37 ℃復(fù)溫30 min，PBS清洗3次；避光加入FITC 標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37 ℃恒溫孵育 1 h；PBS清洗3次；避光加入PI染核4 min，PBS清洗3次；抗熒光淬滅劑封片；在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.4qRT-PCR法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β的mRNA表達(dá) 分組干預(yù)后收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA；檢測RNA的濃度, 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。PCR擴(kuò)增，運行實時定量PCR程序：UDG酶激活50 ℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1min，共40個循環(huán)。根據(jù)數(shù)據(jù)計算每組Ct值，對NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。實驗所有引物見表1。

表1 目的基因引物序列

1.2.5ELISA法檢測心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的表達(dá) 對照說明書配制標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照說明書中具體操作步驟進(jìn)行實驗。所有加樣完畢后，在15～30 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀檢測各組樣品在450 nm/ 540 nm波長處的光密度值(optical density，OD)。以標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線為參照，計算出樣品450 nm/540 nm OD值對應(yīng)的濃度。

2 結(jié)果

2.1 PE急性刺激心肌細(xì)胞后NLRP3表達(dá)上調(diào)Western blot 結(jié)果顯示，使用PE刺激H9C2大鼠心肌細(xì)胞后，NLRP3的蛋白水平快速升高，其表達(dá)峰值在藥物作用15 min時(P<0.01)，隨后蛋白表達(dá)開始下降，見圖1。表明激動心肌細(xì)胞α1-AR可以引起心肌細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活。

圖1 激活心肌細(xì)胞α1-AR使NLRP3表達(dá)上調(diào)(n=3)A：Western blot法檢測50 μmol/L PE干預(yù)H9C2大鼠心肌細(xì)胞后NLRP3的蛋白表達(dá)；B：A圖的統(tǒng)計結(jié)果；a：control組；b-f：50 μmol/L PE干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞5、15、30、60、120 min；與control組比較：##P<0.01

2.2 PE急性刺激心肌細(xì)胞后Cx43 蛋白表達(dá)上調(diào)Western blot結(jié)果顯示，給予PE刺激后，心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，并且隨著PE的干預(yù)呈現(xiàn)時間依賴性變化，在PE刺激15 min后表達(dá)開始下調(diào)，見圖2。表明Cx43參與PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞急性交感應(yīng)激過程。

圖2 PE對H9C2心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的影響(n=3)A：PE干預(yù)不同時間對H9C2心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的影響；B：A圖的統(tǒng)計結(jié)果；a：control組；b-f：50 μmol/L PE干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞5、15、30、60、120 min；與control組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 PE上調(diào)的心肌細(xì)胞Cx43及NLRP3/Caspase-1/IL-18通路蛋白表達(dá)可被Gap26所逆轉(zhuǎn)免疫熒光法檢測結(jié)果顯示Cx43主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，與control組相比，PE刺激后心肌細(xì)胞Cx43 蛋白表達(dá)增加(P<0.01)(圖3)；而Gap26+PE干預(yù)組的Cx43表達(dá)均較PE單獨處理組下調(diào)(P<0.01)。用Western blot法檢測各處理組細(xì)胞NLRP3/Caspase-1/IL-18通路蛋白及Cx43、IL-1β的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，與control組相比，PE單獨處理組能上調(diào)NLRP3/Caspase-1/IL-18通路蛋白及Cx43、IL-1β的蛋白表達(dá)(P<0.05)；與PE單獨處理組相比，Gap26干預(yù)組能下調(diào)NLRP3/Caspase-1/IL-18通路蛋白及Cx43、IL-1β的表達(dá)(P<0.05)。而對于細(xì)胞因子IL-1β及IL-18，ELISA法測定結(jié)果與Western blot法檢測結(jié)果一致(圖5)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 H9C2心肌細(xì)胞上Cx43蛋白的表達(dá)和定位(n=3)A：Cx43在H9C2心肌細(xì)胞中的表達(dá)和定位 ×200；B：Cx43的半定量統(tǒng)計分析結(jié)果；a：control組；b：PE單獨處理組；c：Gap26干預(yù)組；d：Gap26單獨處理組；與control組比較： **P<0.01；與PE單獨處理組比較：##P<0.01；Cx43：綠色；PI(碘化丙啶)：紅色(細(xì)胞核)；Merge：合并圖

圖4 PE及Gap26對H9C2心肌細(xì)胞NLRP3/Caspase-1/IL-18通路蛋白及Cx43表達(dá)的影響(n=3)A：PE上調(diào)的Cx43、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)可被Gap26不同程度逆轉(zhuǎn)；B：Caspase-1、Cx43、NLRP3蛋白表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)分析；C：PE上調(diào)的心肌細(xì)胞因子IL-18、IL-1β表達(dá)可被Gap26逆轉(zhuǎn)；D：IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)分析；a：control組；b：PE單獨處理組；c：Gap26干預(yù)組；d：Gap26單獨處理組；與control組比較：*P<0.05，**P<0.01；與PE單獨處理組較： #P<0.05，##P<0.01

圖5 PE及Gap26對H9C2心肌細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β、IL-18表達(dá)的影響(n=6)A：ELISA法檢測H9C2心肌細(xì)胞IL-1β的表達(dá)；B：ELISA法檢測H9C2心肌細(xì)胞IL-18的表達(dá)；a：control組；b：PE單獨處理組；c：Gap26干預(yù)組；d：Gap26單獨處理組；與control組比較：***P<0.001；與PE單獨處理組比較： ##P<0.01

2.4 Gap26 預(yù)處理抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1 mRNA表達(dá)上調(diào)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與 control組相比，PE單獨處理組NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA水平升高(P<0.05)，而給予Gap26預(yù)處理后NLRP3、Caspase-1、IL-18 mRNA水平相對于PE單獨處理組降低(P<0.01)；IL-1β mRNA表達(dá)水平有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖6。

圖6 PE及Gap26對H9C2心肌細(xì)胞NLRP3、caspase-1、IL-18及IL-1β mRNA水平的影響(n=6)A：control組；b：PE單獨處理組；c：Gap26干預(yù)組；d：Gap26單獨處理組；與control組比較：*P<0.05，**P<0.01；與PE單獨處理組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

心力衰竭是各種心血管疾病的終末期，其發(fā)生發(fā)展過程主要與神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)引起的心肌重塑密切相關(guān)。交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)過度激活在心血管病的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，應(yīng)激刺激引起循環(huán)兒茶酚胺濃度升高，進(jìn)而過量的兒茶酚胺與心臟腎上腺素能受體結(jié)合，激活并進(jìn)一步導(dǎo)致一系列心血管系統(tǒng)病理生理改變。盡管在交感應(yīng)激早期，機(jī)體會表現(xiàn)生理性代償，但若不加以干預(yù)，隨著時間延長呈現(xiàn)交感持續(xù)刺激時，心臟就會出現(xiàn)失代償損害：心肌纖維化、肥大等病理性重塑，而炎癥因子在此過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。此外，促炎性刺激可誘導(dǎo)NLRP3和其他炎性小體成分在心肌細(xì)胞、白細(xì)胞和其他非心肌細(xì)胞駐留細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)中表達(dá)[9-10]。本研究使用50 μmol/L PE作用于H9C2心肌細(xì)胞，通過Western blot檢測不同PE干預(yù)時間下NLRP3的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示PE可上調(diào)NLRP3表達(dá)，并且在15 min時達(dá)到最高峰，之后逐漸下降，由此證實在急性過度激活心臟α1-AR誘導(dǎo)的急性交感應(yīng)激中，NLRP3炎性小體被激活并進(jìn)一步介導(dǎo)心臟炎癥反應(yīng)。

眾所周知，Cx43在心房和心室肌細(xì)胞中表達(dá)最豐富，廣泛參與疾病的發(fā)展。Cx43在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、微管穩(wěn)定性、細(xì)胞周期、分化、增殖和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起重要作用[11-12]。在實驗動物水平及細(xì)胞水平模擬心肌肥大反應(yīng)的相關(guān)研究中，Cx43的分布和表達(dá)變化一直是研究的主要焦點，這些變化背后的分子機(jī)制和信號通路的研究還不夠深入[13-15]。在關(guān)于激活α1-AR表達(dá)心臟Cx43信號通路研究中，顯示PE對乳鼠心肌細(xì)胞24 h的刺激導(dǎo)致Cx43蛋白和mRNA濃度依賴性升高，表明α1-AR刺激對Cx43蛋白和mRNA水平均有調(diào)節(jié)。Cx43的增加可以被PKC抑制劑BIM I或MAPK信號通路的抑制劑阻斷，表明p38和p42/44參與了這一過程[16]。本研究中，給予PE干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞，Cx43的蛋白表達(dá)上調(diào)，其峰值出現(xiàn)在15 min時；免疫熒光顯示Cx43的表達(dá)主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，說明Cx43參與了α1-AR急性過度激活誘導(dǎo)的心臟炎癥過程。而在此急性炎癥過程中，Cx43及NLRP3蛋白表達(dá)均有上調(diào)，且隨時間的變化趨勢基本一致，故推測在心臟急性交感應(yīng)激時Cx43與NLRP3之間可能存在相關(guān)性(圖1～3)。故在接下來的研究中，增加了Cx43特異性抑制劑Gap26來進(jìn)一步探討Cx43與NLRP3炎性小體之間的作用關(guān)系。

在脂多糖誘導(dǎo)急性腎損傷的研究及另一項慢性眼病研究模型中，Cx43表達(dá)的增加與NLRP3表達(dá)直接相關(guān)，增加Cx43水平有助于炎癥小體激活[17-18]。在受損的心肌細(xì)胞中NLRP3炎性小體的形成是保護(hù)性機(jī)制還是進(jìn)一步損傷機(jī)制尚不清楚。本研究的主要目的是希望在急性交感應(yīng)激過程與NLRP3/caspase-1/IL-18通路中尋找一個新的治療靶點。Western blot、qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Cx43特異性阻斷劑Gap26預(yù)處理組與單獨PE干預(yù)組相比，IL-1β與NLRP3、Caspase-1及IL-18的蛋白及mRNA表達(dá)水平均下調(diào)(圖4～6)。使用PE急性過度刺激H9C2心肌細(xì)胞上的α1-AR，可以引起NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的蛋白與mRNA表達(dá)水平增加；ELISA法檢測同樣提示PE干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞，可以使細(xì)胞因子IL-1β及IL-18表達(dá)上調(diào)，而使用特異性抑制劑Gap26可以下調(diào)其表達(dá)。

綜上，Cx43可通過調(diào)控NLRP3炎性小體激活參與α1-AR激活誘導(dǎo)的心臟急性交感應(yīng)激。