王雪芹，劉亞鋒，吳 靜，周家偉，邢應(yīng)如，張 鑫，李丹婷，謝 軍，丁選勝，胡 東

自噬是維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分。在饑餓環(huán)境中，自噬捕獲并降解溶酶體中的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)從而保護(hù)生物體免受疾病侵害，主要包括心臟病、感染和神經(jīng)變性[1]。但有研究[2]表明，黑素瘤和乳腺癌在內(nèi)的癌癥會(huì)誘導(dǎo)自噬并依賴自噬生存。自噬介導(dǎo)的循環(huán)維持能量穩(wěn)態(tài)和線粒體功能可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。因此，抑制自噬功能可能對(duì)癌癥治療產(chǎn)生有益效果。

肺癌占世界新癌癥發(fā)病率和病死率的第一位[3]。近年來腫瘤切除術(shù)、免疫治療和放化療綜合應(yīng)用于治療肺腺癌，但是肺腺癌患者平均5年生存率仍低于20%[4]。因此，鑒定疾病特異性生物標(biāo)志物，提高對(duì)肺腺癌分子機(jī)制的了解，開發(fā)新的治療決策，以改善患者的預(yù)后是非常有必要的。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集于2020年8月從癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載肺腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。從人類自噬數(shù)據(jù)庫(human autophagy database,HADBb)(http：//www.autophagy.lu/)獲得了232個(gè)自噬相關(guān)基因(autophagy related genes，ARGs)。TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的基本臨床特征：女性213例(45.7%)，男性254例(54.3%)；65歲以上有227例(48%)，65歲及以下有240例(52%)；臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別為251例(54%)、108例(23%)、75例(16%)；T1、T2、T3、T4型分別為162例(34%)、244例(52%)、39例(8%)、19例(6%)；M0、M1型分別為314例(92%)、24例(8%)，N分型中N0、N1、N2～3型分別為300例(66%)、87例(19%)、68例(15%)。

1.2 鑒定差異表達(dá)自噬基因自TCGA數(shù)據(jù)庫下載肺腺癌RNAs表達(dá)譜，并從中提取人自噬相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用R軟件“l(fā)imma”軟件包對(duì)正常樣本和癌癥樣本鑒定差異表達(dá)自噬基因(DEARGs)，通過“pheatmap”軟件包繪制熱圖。

1.3 自噬相關(guān)基因預(yù)后模型的構(gòu)建用R語言“survival”程序包進(jìn)行單因素Cox分析，并將初步篩選的基因與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的自噬基因(P<0.05)納入多因素Cox分析，以進(jìn)一步驗(yàn)證基因?qū)Ψ蜗侔┗颊哳A(yù)后的價(jià)值。經(jīng)過上述分析，獲得風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算如下：

其中Coef是系數(shù)，x是每個(gè)選定自噬基因的表達(dá)水平。

1.4 高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的比較為探討風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與肺腺癌預(yù)后之間的關(guān)系，對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行分析。使用R軟件ESTIMATE算法確定每個(gè)樣品的免疫評(píng)分，通過Wilcoxon檢驗(yàn)比較高危組和低危組之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度差異。此外使用CIBERSORT軟件包評(píng)估22種免疫細(xì)胞亞型比例。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)自噬基因使用R軟件整理TCGA數(shù)據(jù)庫中497個(gè)腫瘤樣本及54個(gè)腫瘤患者的癌旁正常樣本。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并從中提取232個(gè)自噬基因(HADb數(shù)據(jù)庫獲得)的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出30個(gè)差異自噬基因(FDR<0.05且|log2FC|>1)。其中有18個(gè)上調(diào)的ARGs[含有桿狀病毒IAP重復(fù)序列5(baculoviral IAP repeat containing 5,BIRC5)、CDKN2A、TMEM74、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1-α(endoplasmic reticulum oxidoreductase 1 alpha，ERO1A)、ATG9B、GAPDH、PTK6、EIF4EBP1、整合素4 (integrin subunit beta 4,ITGB4)、VMP1、IFNG、ATIC、BNIP3、IKBKE、P4HB、PARP1、ERBB2和HSPA5]和12個(gè)下調(diào)的ARGs[MAP1LC3C、GRID1、CCL2、PRKCQ、NRG1、FOS、PPP1R15A、DAPK2、HSPB8、NLR家族含有CARD結(jié)構(gòu)域4 (NLR family CARD domain containing 4,NLRC4)、DLC1和NRG3]。見圖1。

圖1 肺腺癌和正常組織間差異表達(dá)的自噬基因

2.2 肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)自噬基因鑒定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型構(gòu)建為初步篩選與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的自噬基因，對(duì)差異表達(dá)的30個(gè)自噬mRNAs進(jìn)行單因素Cox回歸分析，共發(fā)現(xiàn)有9個(gè)自噬基因與患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05)(圖2A)。經(jīng)過多變量Cox回歸分析確定4個(gè)自噬基因用于構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型(圖2B)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算方法如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(0.123 746×BIRC5表達(dá)量)+(0.324 086×ERO1A表達(dá)量)+(0.121 162×ITGB4表達(dá)量)+(-0.547 430×NLRC4表達(dá)量)。

通過風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型來計(jì)算497例患者的風(fēng)險(xiǎn)值并以中位值將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組。HR(風(fēng)險(xiǎn)比)>1的基因(BIRC5、ERO1A、ITGB4)被認(rèn)為是危險(xiǎn)基因，而HR<1的基因(NLRC4)被認(rèn)為是保護(hù)性基因。隨風(fēng)險(xiǎn)值升高，病例病死率呈升高趨勢(shì)(圖2C)。高風(fēng)險(xiǎn)組患者表達(dá)危險(xiǎn)基因增多，表達(dá)保護(hù)基因減少(圖2D)。

圖2 預(yù)后相關(guān)自噬基因篩選及表達(dá)特征A：自噬相關(guān)基因的單變量Cox回歸分析；B：自噬相關(guān)基因的多變量Cox回歸分析；C：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和患者生存時(shí)間以及生存/死亡狀態(tài)的分布；黑色虛線：將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組的最佳臨界值；D：低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組自噬相關(guān)基因表達(dá)譜

2.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型中基因的蛋白表達(dá)水平為了進(jìn)一步確定這4個(gè)自噬基因在肺腺癌中的表達(dá)，利用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(HPA)的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與正常肺組織相比，肺腺癌中的BIRC5、ERO1A、ITGB4表達(dá)增加，而NLRC4在腫瘤細(xì)胞中則未發(fā)現(xiàn)(圖3)。肺腺癌中BIRC5、ERO1A、ITGB4、NLRC4蛋白水平的變化與其基因水平的變化一致。

圖3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型中4個(gè)基因的蛋白表達(dá)水平A:BIRC5；B:ERO1A；C:ITGB4；D:NLRC4

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的性能檢測(cè)Log-rank檢驗(yàn)對(duì)低、高風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存期較差(P<0.000 1)，見圖4A。ROC曲線下面積(AUC)用來評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型預(yù)測(cè)效能，該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型預(yù)測(cè)患者1年生存率的AUC值為0.757(95%CI：0.727～0.787),3年生存率的AUC值為0.723(95%CI：0.667～0.779)，說明該模型具有良好的短期預(yù)測(cè)能力(圖4B)。然而，5年生存率的AUC值僅為0.581(95%CI：0.516～0.646),提示該模型不能很好地預(yù)測(cè)患者長(zhǎng)期(5年以上)生存狀態(tài)。采用ROC曲線比較風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與四個(gè)單基因及臨床參數(shù)的預(yù)測(cè)能力，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的AUC為0.757(95%CI：0.727～0.787)；BIRC5的AUC為0.667(95%CI：0.609～0.725)；ERO1A的AUC為0.700(95%CI：0.649～0.751)；ITGB4的AUC為0.621(95%CI：0.555～0.687)；NLRC4的AUC為0.329(95%CI：0.258～0.400)；年齡的AUC為0.511(95%CI：0.442～0.580)；性別的AUC為0.578(95%CI：0.512～0.644)；疾病分期的AUC為0.721(95%CI：0.670～0.772)；T分型的AUC為0.671(95%CI：0.617～0.725)；M分型的AUC為0.504(95%CI：0.434～0.574)；N分型的AUC為0.674(95%CI：0.622～0.726)(圖4C、4D)。Delong檢驗(yàn)表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的AUC高于年齡(P=0.033)、性別(P=0.039)、T分型(P=0.047)、M分型(P=0.031)及N分型(P=0.042)的AUC，但是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與疾病分期的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.083)，其原因可能是樣本量不足。由此可見，無論與單基因或者其他臨床參數(shù)相比，該模型具有較好的預(yù)測(cè)能力和準(zhǔn)確性。

圖4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型高、低風(fēng)險(xiǎn)組Kaplan-Meier曲線、ROC曲線及臨床參數(shù)的相關(guān)性A:基于4個(gè)自噬基因的KM曲線；B:基于4個(gè)自噬基因ROC曲線；C:基于4個(gè)自噬基因與單獨(dú)自噬基因的ROC曲線；D:基于4個(gè)自噬基因與臨床參數(shù)的ROC曲線

2.5 高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫浸潤(rùn)評(píng)分免疫評(píng)分顯示高、低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組之間存在差異(圖5A)。Kaplan-Meier分析顯示，肺腺癌中不同的免疫評(píng)分具有不同的生存期(圖5B)。肺腺癌的22種免疫細(xì)胞比例，其中M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞CD4、CD8為肺腺癌浸潤(rùn)主要免疫細(xì)胞亞群(圖5C)。在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中，有10群免疫細(xì)胞水平存在差異，其中CD4記憶靜止細(xì)胞、CD4記憶激活細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、靜止樹突狀細(xì)胞、肥大靜止細(xì)胞及肥大激活細(xì)胞差異最為明顯(圖5D)。

圖5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性A:免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的關(guān)聯(lián)；B:免疫評(píng)分對(duì)肺腺癌總體生存影響的KM分析；C:肺腺癌中22種免疫細(xì)胞的比例；D:高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫細(xì)胞差異性表達(dá)；與高風(fēng)險(xiǎn)組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

3 討論

自噬是腫瘤起始和癌癥進(jìn)展的抑制因子，而在腫瘤晚期自噬作為促進(jìn)生存、生長(zhǎng)和侵略性的保護(hù)因子。越來越多的證據(jù)表明自噬與癌癥密切相關(guān)。如NLRC5通過抑制自噬能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖[5]；孕酮和脂聯(lián)素受體3(PAQR3)通過調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)介導(dǎo)的自噬抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[6]；下調(diào)自噬通過抑制GLI系列鋅指2(GLI2)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)Shh途徑抑制的抗肺腺癌功效[7]。

本文基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床資料，結(jié)合HADBb進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明BIRC5、ERO1A和ITGB4是肺腺癌危險(xiǎn)因素，NLRC4是肺腺癌保護(hù)因素。BIRC5能夠通過啟動(dòng)抗凋亡機(jī)制引起肺癌細(xì)胞增殖、腫瘤形成并可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放射治療的耐藥性[8-9]；ERO1A能夠通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，激活腫瘤血管生成信號(hào)從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[10]；ITGB4能夠調(diào)控腫瘤、呼吸系統(tǒng)疾病和神經(jīng)系統(tǒng)病變等多種疾病的進(jìn)展[11]。NLRC4通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞死亡來預(yù)防結(jié)直腸癌[12]。本研究利用自噬相關(guān)基因結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建肺腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，總結(jié)出高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存期較差，且無論與單基因或其他臨床參數(shù)相比，該模型能較好地預(yù)測(cè)肺腺癌患者預(yù)后。

目前，免疫療法是肺腺癌的一種治療方案，已有研究證明免疫細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞上的作用。此外，肺腺癌組織中的免疫成分可用于評(píng)估患者的治療效果和肺腺癌預(yù)后[13]。該研究結(jié)果表明，4個(gè)自噬基因組合的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫浸潤(rùn)評(píng)分具有相關(guān)性。使用CIBERSORT算法計(jì)算免疫細(xì)胞亞型，結(jié)果顯示，高、低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組表達(dá)不同的免疫細(xì)胞亞型，表明免疫細(xì)胞成分比例失衡與癌癥患者的不良預(yù)后和低存活率相關(guān)。肺腺癌中的免疫細(xì)胞主要包括M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、CD4+記憶靜止T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。其中，高風(fēng)險(xiǎn)組CD4+記憶靜止T細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞水平較低，而M0巨噬細(xì)胞水平較高。這暗示著高危組中CD4+記憶靜止T細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞比例的失衡可能降低患者的生存率。