王 蒙，朱曉晗，劉曉蕊，李 琳，王 盈，楊海元，戴一凡

遺傳性血管性水腫(hereditary angiodema，HAE)是一種罕見(jiàn)的，以皮膚和黏膜下腫脹為特征的潛在威脅生命的疾病，常見(jiàn)受累部位為面部、四肢、軀干、生殖道、上呼吸道和胃腸道[1]。1888年，William Osler確定遺傳性血管性水腫為常染色體顯性遺傳病[2]，表明編碼補(bǔ)體C1抑制劑的基因突變是HAE發(fā)病的根本原因。經(jīng)典的HAE是由于編碼補(bǔ)體C1抑制劑的基因SERPING1突變?cè)斐蒣3],HAE-Ⅰ型患者，突變分布整個(gè)基因序列，HAE-Ⅱ型突變主要位于SERPING1第八號(hào)外顯子，第八號(hào)外顯子編碼補(bǔ)體C1抑制劑的反應(yīng)中心環(huán)。補(bǔ)體C1抑制劑的反應(yīng)中心環(huán)為C1抑制劑與靶蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)，若編碼該功能域序列的SERPING1第八號(hào)外顯子突變則導(dǎo)致補(bǔ)體C1抑制劑的功能缺陷。因此，筆者選擇敲除對(duì)應(yīng)基因序列，用于建立疾病模型。

近年來(lái)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便，基因編輯效率高而引起廣泛關(guān)注，已成功應(yīng)用于基因修飾的豬等大動(dòng)物模型構(gòu)建[4-6]。豬的解剖結(jié)構(gòu)與生理情況都與人的極其相似,被視為研究人類疾病的理想大動(dòng)物模型。該研究擬利用CRISPR/Cas9建立SERPING1敲除細(xì)胞系，為后續(xù)構(gòu)建SERPING1敲除克隆豬，模擬遺傳性血管性水腫疾病奠定重要前期工作。

1 材料與方法

1.1 主要材料引物和磷酸化的寡核苷酸序列(金斯瑞公司)；豬胎兒成纖維細(xì)胞(南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省異種移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室) ；pX330質(zhì)粒(Addgene 423230)、Bbs1限制性內(nèi)切酶、Quick Ligase連接酶、DH5α感受態(tài)和質(zhì)粒小提中量試劑盒(北京天根生化科技公司)；Basic NucleofectorTMKits和細(xì)胞轉(zhuǎn)染儀(德國(guó)Lonza公司)；胰酶、胎牛血清、Penn/Strep雙抗、DMEM培養(yǎng)基和PBS緩沖液(美國(guó)Gibco公司)；T7E1酶(美國(guó)New England Biolabs公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；pMD18-T載體(日本Takara公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人/豬SERPING1氨基酸序列同源性分析 使用Clustal軟件對(duì)人和豬兩個(gè)物種進(jìn)行SERPING1氨基酸序列比對(duì)，比較分析SERPING1在人和豬上的同源保守性。

1.2.2人/豬SERPING1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 利用SOPMA軟件對(duì)人/豬SERPING1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)了人/豬SERPING1蛋白α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲的比例。采用Swiss Model軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行SERPING1蛋白三維建模，比較人/豬的二級(jí)和三維結(jié)構(gòu)的一致性。

1.2.3SERPING1-Exon8靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和pX330-Exon8載體構(gòu)建 參照NCBI上豬SERPING1序列，使用CRISPR在線設(shè)計(jì)軟件(http：//crispr.mit.edu/)在第八號(hào)外顯子上設(shè)計(jì)一對(duì)20 bp的單導(dǎo)向RNA(single guide RNA，sgRNA)序列，5′末端加上磷酸化修飾，由金斯瑞公司合成。設(shè)計(jì)了兩對(duì)sgRNA寡核苷酸序列，SERPING1-Exon8-Oligo1 F:5′-CACCGctctgtggcccgcagtttgc-3′，SERPING1-Exon8-Oligo1 R:5′-AA ACgcaaactgcgggccacagagC-3′，SERPING1-Exon8-Oligo2 F:5′-CACCGtcccagagcacgaaaaggaa-3′，SERPING1-Exon8-Oligo2 R:5′-AAACttccttttcgtgctctgggaC-3′。

接下來(lái)進(jìn)行寡核苷酸鏈的退火、酶切、連接(參照http://www.genome-engineering.org/crispr/)首先將每條寡核苷酸鏈稀釋為100 μmol/L，退火形成雙鏈：正向Oligo 1 μl,反向Oligo 1 μl，去離子水8 μl，PCR程序：37 ℃，30 min；95 ℃，5 min；-5 ℃/min，降至25 ℃；4 ℃保持。BbsⅠ線性化的pX330載體與退火雙鏈Oligo(稀釋250倍)連接，然后轉(zhuǎn)化到DH5α中，挑取單克隆菌落，測(cè)序公司驗(yàn)證。驗(yàn)證成功后使用試劑盒提取質(zhì)粒，并用50%甘油保留菌種。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性單克隆細(xì)胞的篩選和鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：原代豬胎兒成纖維細(xì)胞(巴馬小型豬，♂)復(fù)蘇后培養(yǎng)在含16%胎牛血清的培養(yǎng)基中，長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Thermo CountessIIFL)測(cè)量細(xì)胞密度約4.7×106個(gè)/ml，配制轉(zhuǎn)染液,共轉(zhuǎn)染1 μg pX330-Exon8-1質(zhì)粒和1 μg pX330-Exon8-2質(zhì)粒，使用U-023核轉(zhuǎn)程序。用2 ml培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，分至10 cm培養(yǎng)皿中。隔天換用含G418(1 mg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，據(jù)此調(diào)整培養(yǎng)基中G418濃度。

挑取單克隆細(xì)胞：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)9 d的藥篩，可觀察到單克隆細(xì)胞群。顯微鏡下在10 cm培養(yǎng)皿的皿底標(biāo)記單克隆細(xì)胞群的位置。吸出培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，在合適的克隆環(huán)中加入0.25%的胰蛋白酶消化單克隆細(xì)胞群，用Eppendorf微量移液器移入24孔板中，將克隆轉(zhuǎn)移時(shí)間及編號(hào)標(biāo)記在孔板蓋子上。

細(xì)胞傳代和凍存：觀察24孔板中的細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化傳至12孔板，長(zhǎng)滿凍存。

提取凍存細(xì)胞基因組：留存在24孔板的細(xì)胞長(zhǎng)滿后，消化，離心，加入NP40裂解細(xì)胞，提取基因組。

TA克隆鑒定細(xì)胞基因型：PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)條件95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；56.5 ℃，30 s；72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)，總延伸72 ℃，7 min；切膠回收，連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，涂板。每個(gè)固體培養(yǎng)基挑取15個(gè)單克隆菌落，送到公司測(cè)序，比對(duì)敲除細(xì)胞基因型。

1.2.5T7E1酶切檢測(cè)突變 提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組，擴(kuò)增目的片段，對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收。T7E1酶切體系：取純化產(chǎn)物5 μl，10 × NEBuffer 2.0 2 μl，Nuclease-free水12 μl，在PCR儀中進(jìn)行退火反應(yīng)，結(jié)束后各取9.5 μl退火產(chǎn)物，分別加入0.5 μl T7E1酶和去離子水，去離子水作為對(duì)照，37 ℃孵育15 min，加入Proteinase K 0.5 μl失活T7E1酶，采用1%瓊脂糖凝膠電泳后分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 人/豬SERPING1氨基酸序列同源性分析結(jié)果人和豬蛋白的氨基酸序列比對(duì)顯示，二者SERPING1氨基酸排列順序相似性達(dá)到65.87%，人/豬SERPING1蛋白的同源性較高。見(jiàn)圖1。

圖1 人與豬SERPING1蛋白氨基酸同源性分析

2.2 人/豬SERPING1蛋白結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果利用SOPAM(蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件)對(duì)人和豬SERPING1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。其中預(yù)測(cè)到人SERPING1蛋白Alpha helix占39.60%，Beta turn占4.8%，Extended strand占15.20%，Random coil占40.40%。豬SERPING1蛋白Alpha helix占39.92%，Beta turn占3.87%，Extended strand占12.01%，Random coil占44.20%。由此推算，SERPING1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在人和豬上一致性較高(圖2A)。蛋白三維結(jié)構(gòu)顯示人/豬SERPING1相似(圖2B)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，人(Homo sapiens)和豬(Sus scrofa)SERPING1分子具有較近的親緣關(guān)系，序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析具有高度的同源性，推測(cè)SERPING1在Homo sapiens/Sus scrofa的血漿接觸級(jí)聯(lián)系統(tǒng)發(fā)揮相近的生物學(xué)功能。

圖2 人與豬SERPING1蛋白質(zhì)二級(jí)，三維結(jié)構(gòu)分析A：人/豬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比較；B：人/豬蛋白質(zhì)三維建模結(jié)果對(duì)比；藍(lán)色：α螺旋；綠色：β轉(zhuǎn)角；紅色：延長(zhǎng)鏈；黃色：無(wú)規(guī)則卷曲

2.3 重組打靶載體測(cè)序pX330載體上連接SERPING1基因靶點(diǎn)sgRNA序列。5′-ACTATCATATGCTTAC-3′為U6啟動(dòng)子序列(圖3A)。重組載體pX330上成功插入SERPING1Exon8的靶點(diǎn)sgRNA序列(圖3B)。

圖3 重組載體的構(gòu)建與測(cè)序A:Cas9骨架載體pX330圖譜，Bbs1酶切位點(diǎn)；B:重組載體測(cè)序圖

2.4SERPING1基因敲除情況的驗(yàn)證轉(zhuǎn)染pX330-Exon8-1和pX330-Exon8-2載體的豬胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物目的條帶下面有被剪切過(guò)的片段條帶。驗(yàn)證了第八外顯子靶點(diǎn)發(fā)生了堿基的突變。見(jiàn)圖4。

圖4 兩個(gè)sgRNA敲除情況驗(yàn)證M：100 bp marker；WT-Y：加入T7E1酶的野生型基因組；E8-Y：加T7E1酶的第八外顯子敲除基因組

2.5SERPING1敲除細(xì)胞系的基因型鑒定共獲得44個(gè)單克隆，進(jìn)行TA克隆測(cè)序。PCR所用的引物如下，F(xiàn):5′-AACTTGGGAGCAACCCAGAAA-3′，R:5′-TCACAGGGAAGGGATGGTAGA-3′。測(cè)序結(jié)果顯示SERPING1基因的第八外顯子靶點(diǎn)區(qū)域?yàn)槿笔蛔?。其中，最常出現(xiàn)的突變類型為缺失29個(gè)堿基。見(jiàn)圖5。

圖5 單克隆細(xì)胞在目的sgRNA位點(diǎn)的缺失情況

3 討論

遺傳性血管性水腫是一種罕見(jiàn)遺傳病，發(fā)病率為1/50 000至1/10 000[7]，會(huì)導(dǎo)致水腫(腫脹)反復(fù)發(fā)作。因喉部水腫導(dǎo)致呼吸道梗阻患者窒息，引起廣大臨床工作者的重視。但目前因?yàn)槠浔容^罕見(jiàn)，導(dǎo)致醫(yī)務(wù)工作者對(duì)其認(rèn)知還不透徹，易被誤診為其他疾病。并且我國(guó)目前還沒(méi)有新型治療藥物，所以急需動(dòng)物模型，對(duì)其發(fā)病機(jī)制有更進(jìn)一步的了解并據(jù)此研制新型治療藥物緩解患者的痛苦[8]。現(xiàn)有的研究[9-10]顯示HAE的發(fā)病機(jī)制除了與C1INH有關(guān)，第三型遺傳性血管性水腫還與凝血因子FXII有關(guān)，第四型還與其他蛋白酶有關(guān)。將來(lái)有必要進(jìn)一步探索不同類型的發(fā)病機(jī)制。

本研究重點(diǎn)關(guān)注與C1INH有關(guān)的一型和二型HAE，有關(guān)SERPING1單基因敲除的克隆鼠雖有報(bào)道[11]，但無(wú)法復(fù)制人遺傳性血管性水腫表型，以巴馬小型豬胎兒成纖維細(xì)胞為材料，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建SERPING1-/-細(xì)胞系。首先通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，豬的SERPING1蛋白無(wú)論是在氨基酸排列順序、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維空間上都與人具有較高的相似性，并且其生物特征更貼合人類，所以豬是構(gòu)建HAE的理想模型。CRISPR/Cas9的深入研究使得該技術(shù)成為動(dòng)植物基因功能研究和建立動(dòng)物細(xì)胞系[12-14]主要手段，因此本實(shí)驗(yàn)也選擇該技術(shù)作為主要研究手段。

目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)450種與補(bǔ)體C1抑制劑缺乏致遺傳性血管性水腫相關(guān)的基因突變[15],集中于SERPING1的第八號(hào)外顯子。因此，選擇在第八號(hào)外顯子上設(shè)計(jì)打靶載體，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證敲除的基因型，發(fā)現(xiàn)敲除的形式比較穩(wěn)定，均為靶點(diǎn)附近29 bp的缺失，若用于后續(xù)模型的構(gòu)建，動(dòng)物的表征一致，方便分析。共挑選了44個(gè)細(xì)胞克隆，經(jīng)鑒定產(chǎn)生了12個(gè)敲除成功的單克隆細(xì)胞系，敲除效率較高，敲除單個(gè)基因是可能的原因之一，且在這基因上同時(shí)設(shè)計(jì)兩個(gè)打靶載體也有效地提高了基因編輯效率。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了SERPING1-/-豬胎兒成纖維細(xì)胞系，為后續(xù)構(gòu)建SERPING1-/-巴馬小型豬遺傳性血管性水腫模型，以及研究相關(guān)機(jī)制提供了重要的供體細(xì)胞。