金科旭，戴小華，谷虹霏，束佳敏，王天琪，海婷玉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】野山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam.)屬薔薇科李亞科杏屬的亞喬木植物，果肉中含有大量的黃酮類化合物。黃酮類化合物具有降血脂[1]、降血糖[2]、抗氧化[3, 4]、抗菌[5]、鎮(zhèn)痛抗炎[6-7]等藥理作用。從野山杏中提取的總黃酮含量較低。【前人研究進展】野山杏醇提物中總黃酮含量僅為5.39%[9]，影響著野山杏資源的開發(fā)利用。大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的高分子材料，具有選擇性吸附功能，主要作用于天然植物中活性的分離純化[10, 11]，具有成本低、分離效率高、操作簡單、無毒性、可工業(yè)化大批量生產(chǎn)等優(yōu)點[12]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對于大孔樹脂純化植物中總黃酮成分的報道很多[13, 14]，但關于大孔樹脂分離純化野山杏總黃酮的研究尚未報道。需要研究優(yōu)選大孔樹脂分離純化野山杏總黃酮的最佳工藝參數(shù)?！緮M解決的關鍵問題】采用AB-8、D-101、NAK-9、ADS-17四種大孔樹脂靜態(tài)比吸附量及比解吸附量為指標確定純化最佳大孔樹脂，并在此基礎上選出最佳純化條件，為野山杏總黃酮開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

野山杏干燥果肉(新疆哈密伊吾縣)，蘆丁≥98%(上海源葉生物科技有限公司)，D-101、ADS-17、AB-8、NAK-9大孔吸附樹脂(天津市光復精細化工研究所)。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：無水乙醇(天津，)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)。

儀器：JBT/C-YCL400T/3P(D) 超聲波藥品處理機(濟寧金百特工程機械有限公司)、RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮化儀器廠)、T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)、DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)、SL202N電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 野山杏總黃酮提取液制備

干燥后的野山杏果肉粉碎過40目篩，加入50%乙醇(料液比為1∶50)超聲1 h，提取2次，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干乙醇即得到總黃酮粗提物，然后用蒸餾水將總黃酮粗提物稀釋成不同質(zhì)量濃度的待測液。

1.2.2 標準曲線的建立及樣品總黃酮含量測定

1.2.2.1 對照品儲備液制備

精確量取25.00 mg蘆丁標準品于深色容量瓶中，并用60%乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中，混勻，即得濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

1.2.2.2 線性關系[15, 16]

精密吸取制得的蘆丁標準品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25 mL棕色容量瓶中，滴加5% NaNO2溶液0.7 mL，混勻室溫靜置6 min，滴加10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，混勻室溫靜置6 min，加4% NaOH溶液4 mL后混勻，用60%乙醇定容至刻度并于室溫下靜置15 min，在510 nm波長下用紫外可見分光光度計測定吸光值A，回歸方程為y=13.851x-0.016 8，r2=0.999 4，線性關系良好。

1.2.3 不同型號吸附樹脂的篩選

1.2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理[17]

將4種大孔吸附樹脂(AB-8、D-101、NAK-9、ADS-17)用蒸餾水清洗除去雜物及破碎樹脂， 95%乙醇浸泡24 h后蒸餾水沖洗至無醇味。用5% HCl溶液浸泡6 h后用蒸餾水清洗至pH值為中性，再用5% NaOH溶液浸泡6 h后用蒸餾水清洗至pH值為中性，備用。

1.2.3.2 靜態(tài)吸附-解吸性能[18]

(1)準確稱量處理好的樹脂各10.0 g置于錐形瓶中，分別加入野山杏總黃酮粗提液40 mL，在100 r/min，37℃恒溫振蕩24 h，充分吸附后抽濾并收集濾液，測量濾液吸光度值，計算濾液中總黃酮質(zhì)量濃度量和比吸附量。

比吸附量=(樹脂吸附前總黃酮質(zhì)量濃度-樹脂吸附后總黃酮質(zhì)量濃度)×溶液體積/樹脂質(zhì)量。

(2)各取2 g吸附飽和樹脂于100 mL錐形瓶中，精確加入50 mL 95%乙醇，在150 r/min，25℃下恒溫振蕩24 h，充分解吸后抽濾收集濾液，測定解吸液中野山杏總黃酮的質(zhì)量濃度及解吸率。

比解吸量= (解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度×解吸液體積)/樹脂質(zhì)量。

解吸率(%)=比解吸量/比吸附量×100%。

1.2.4 D-101大孔吸附樹脂純化工藝

1.2.4.1 徑高比

將野山杏總黃酮粗提液以1.0 mL/min的流速通過不同徑高比(1∶4，1∶6，1∶8)的大孔樹脂柱，吸附完全后用蒸餾水洗脫，再用80%乙醇洗脫，以洗脫液總黃酮含量為指標分析不同徑高比對純化工藝的影響。

1.2.4.2 最大體積

將野山杏總黃酮粗提液按1.0 mL/min的流速通過大孔樹脂柱，分段收集流出溶液，計算流出液總黃酮含量。以野山杏總黃酮的泄漏量為指標考察樣品溶液的最大上樣量。

泄露百分數(shù)(%)=流出液總黃酮含量/上樣液總黃酮含量×100%。

1.2.4.3 上樣流速

將200 mL上樣液分別以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速上樣，測量上樣前后總黃酮的含量，以野山杏總黃酮吸附量為指標考察上樣速度對純化工藝的影響。

吸附量(mg)=上樣液總黃酮含量-流出液總黃酮含量。

1.2.4.4 上樣濃度

配置濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的野山杏總黃酮溶液上樣，上樣完全后用80%乙醇洗脫劑進行洗脫，收集洗脫溶液，以洗脫溶液中的總黃酮含量為指標，分析上樣濃度對純化工藝的影響。

1.2.4.5 吸附時間

以濃度為0.3 mL/min的野山杏總黃酮溶液上樣后，分別靜置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，然后用80%乙醇進行洗脫，收集洗脫樣液，以洗脫溶液中的總黃酮含量為指標，分析吸附時間對純化工藝的影響。

1.2.4.6 水洗脫液體積

上樣完成后用蒸餾水控制流速除去保留在樹脂柱中的多糖，多糖鑒定方法為Molish反應法。當Molish反應為陰性，在510 nm處無吸收時，測量蒸餾水體積。

1.2.4.7 水洗脫液流速

上樣吸附后用蒸餾水以0.5、1.0、1.5 mL/min流速進行洗脫，計算水洗脫液中總黃酮泄露百分數(shù)，以泄露百分數(shù)為指標分析水洗液流速對純化工藝的影響。

1.2.4.8 洗脫劑的濃度

以濃度為0.3 mg/mL的野山杏總黃酮溶液160 mL上樣，靜止2 h后用蒸餾水洗脫，依次用50%、60%、70%、80%、90%體積濃度的乙醇溶液進行洗脫后，收集洗脫液，計算解吸率。以解吸率為指標，分析洗脫劑的濃度對純化工藝的影響

1.2.4.9 洗脫劑流速

上樣吸附后，用80%乙醇溶液分別以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速洗脫。以洗脫液中總黃酮含量為指標分析洗脫流速對純化工藝的影響。

1.2.4.10 洗脫劑體積

上樣吸附后，用80%體積濃度的乙醇溶液分別以0.5 mL/min的流速洗脫，分段收集洗脫液，每5 mL為1份，以總黃酮含量為指標考察洗脫劑的用量。

1.2.4.11 精制品總黃酮的含量

按照單因素最佳的上樣和洗脫條件，以最終提取物中野山杏總黃酮的含量為考察指標進行平行試驗(n=3)，驗證實驗的可重復性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大孔吸附樹脂靜態(tài)比吸附量及比解吸附量

研究表明，D-101大孔吸附的比吸附量為1.364 mg/g、比解吸附量為0.197 mg/g、解吸率為14.44%。均優(yōu)于其他3種樹脂，故選擇D-101大孔吸附樹脂對野山杏總黃酮進行分離純化。表1

表1 4種大孔樹脂對野山杏總黃酮靜態(tài)比吸附量及比解吸量測定Table 1 Determination of specific adsorption capacity and specific desorption capacity of four kinds of macroporous resins on total flavonoids of Armeniaca sibirica(L.)Lam

2.2 徑高比對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當大孔樹脂柱徑高比為1∶6時，洗脫液中野山杏總黃酮含量最高，選擇徑高比為1∶6的大孔樹脂柱作為純化樹脂柱。表2

表2 徑高比變化Table 2 Inspection results of the ratio of height to height

2.3 不同上樣體積下大孔吸附樹脂純化工藝的變化

研究表明，當樣品體積大于160 mL時，流出液中總黃酮含量明顯增多，此時總黃酮開始明顯泄漏。野山杏提取液的最大上樣量為160 mL，即6.3 BV(6.3倍柱體積)。圖1

圖1 泄漏曲線Fig.re1 Leakage curve

2.4 上樣流速對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，上樣流速為1.0 mL/min時與0.5 mL/min時，野山杏總黃酮吸的附量無明顯差別，采樣速率為1.0 mL/min作為最佳上樣流速。表3

表3 上樣流速Table 3 Sample flow rate

2.5 上樣濃度對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當上樣液濃度達到0.3 mg/mL時，洗脫液中總黃酮含量達到最大，隨后當上樣液濃度繼續(xù)增大時洗脫液中總黃酮含量逐漸降低，最佳上樣濃度為0.3 mg/mL。表4

表4 上樣濃度Table 4 Sample Concentration Inspection Results

2.6 吸附時間對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

上樣后，靜置吸附時間2 h時，吸附效果最佳，故選擇吸附2 h為最佳吸附時間。表5

表5 吸附時間Table 5 Inspection results of adsorption time

2.7 水洗脫液體積對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當收集到5 BV時觀察Molish反應為陰性，同時在510 nm處無吸收，此時還原糖已去除且無總黃酮成分流出。確定水洗脫液用量為5 BV。

2.8 水洗脫液流速對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

當水洗液流速為0.5 mL/min時洗脫效果最佳，但由于三組數(shù)據(jù)差別不顯著，故選擇1.5 mL/min為洗脫條件。表6

表6 水洗脫液流速下泄露百分數(shù)Table 6 Effect of Washing Fluid Flow Rate on Leakage Percentage

2.9 洗脫劑濃度對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

因為D101大孔吸附樹脂是弱極性樹脂，而低濃度的乙醇極性較大，根據(jù)相似相容原理，應選擇極性較小的高濃度乙醇[19]，解吸率隨乙醇體積分數(shù)的增加而平緩上升，當乙醇體積分數(shù)為80%后，總黃酮的洗脫效果差異不大。洗脫劑濃度為80%乙醇。圖2

圖2 不同乙醇濃度下解吸率Fig.2 Effect of different ethanol concentration on desorption rate

2.10 洗脫劑流速對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

洗脫液流速為0.5 mL/min時洗脫效果最優(yōu)，故選擇0.5 mL/min為最佳洗脫流速。表7

表7 洗脫流速考察結(jié)果Table 7 Flow rate of the elution flow

2.11 洗脫劑體積對大孔吸附樹脂純化工藝的影響

研究表明，當洗脫劑用量為50 mL時，即2 BV趨于洗脫終點。確定2 BV(50 mL)為最佳洗脫量。圖3，圖4

2.12 驗證試驗

研究表明，通過D-101大孔樹脂的分離純化，野山杏總黃酮含量達到52.37%。表8

圖3 洗脫劑用量Fig.3 Eluent Usage Survey Results

表8 總黃酮含量Table 8 Total flavonoid content results

3 討 論

大孔樹脂具有吸附能力強且易洗脫、可循環(huán)使用且再生處理經(jīng)濟環(huán)保、方便制劑成型等優(yōu)勢，近年來大量用于天然產(chǎn)物中有機成分的分離純化[15]。許志新等[16]研究發(fā)現(xiàn)，D101大孔樹脂能將紫玉米穗軸中花青素含量由粗提物中的0.74%純化至29.76%，提高近40倍。不同極性、不同孔徑的樹脂其相應的適應范圍不同，因此，對于不同成分的分離純化的性能也是有所差異[20]。崔新梅等[18]通過對比8種大孔樹脂發(fā)現(xiàn)，AB-8型樹脂對敗醬草中黃酮類化合物有較好的吸附效果。王慧芳等[19]研究發(fā)現(xiàn)，非極性大孔樹脂HP-20更適合分離純化陳皮黃酮。野山杏是新疆廣泛分布的一種特色植物，具有豐富的營養(yǎng)價值，總黃酮是其有效成分之一。但野山杏醇提物中總黃酮含量較低，很難用于商業(yè)化，而大孔吸附樹脂技術因較為廣泛地應用于總黃酮分離純化，且效果顯著、工藝簡單穩(wěn)定、成本較低，所以為野山杏中總黃酮成分的工業(yè)化生產(chǎn)提供了更多可能[21, 22]。

4 結(jié) 論

篩選出D101型大孔樹脂為最適合野山杏總黃酮的富集，最佳工藝為：最大上樣量為6.3BV，上樣速度為1.0 mL/min，上樣濃度為0.3 mg/mL，大孔吸附樹脂吸附靜止2 h后，用5 BV的蒸餾水以即1.5 mL/min的流速洗脫，棄去水洗脫液，再以0.5 mL/min流速，2 BV用量的80%乙醇進行洗脫，將洗脫液干燥得深棕色固形物，經(jīng) D-101型大孔樹脂純化后的野山杏總黃酮含量為52.37%。