陳月星，徐愉聰，張曉虎

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院/陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西商洛 726000）

南五味子（Kadsura longepedunculata）[1]，是南五味子屬，系陜南山區(qū)商洛市主產(chǎn)的量大質(zhì)優(yōu)的“五大商藥”之一[2-3]。南五味子的成熟果實(shí)性溫且兼具甘、酸、辛、苦、咸五味，不僅作為傳統(tǒng)大宗道地中藥材得到廣泛應(yīng)用，而且提取分離其功能性成分并探索在食品中的應(yīng)用成為食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。南五味子中的五味子乙素（Schisandrin B）對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟具有保護(hù)作用[7]，能降低動(dòng)物體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，減輕四氯化碳中毒對(duì)肝臟的損害，同時(shí)具有一定的抗氧化抑菌和降低自由基影響的作用[8]，可使機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)，使脂質(zhì)過(guò)氧化損傷降低[9]。已有研究表明五味子乙素除諸多藥用價(jià)值外，極具成為天然食品防腐保鮮劑的潛力[1，4-6]。本研究選取商洛南五味子為材料，采用乙醇浸提法提取其果實(shí)中的五味子乙素，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。設(shè)計(jì)由五味子乙素溶液、維生素C、檸檬酸及黃原膠為主要成分的復(fù)配保鮮劑的優(yōu)化組合方案，并將制備的復(fù)合保鮮劑用于雞蛋貯藏保鮮，以期為商洛南五味子在食品防腐保鮮中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

南五味子果實(shí)，2021年8月在陜西省商洛市山陽(yáng)縣高壩鎮(zhèn)采摘；當(dāng)天所產(chǎn)新鮮雞蛋，購(gòu)于商洛市商州區(qū)沙河子鎮(zhèn)養(yǎng)雞場(chǎng)；一次性泡沫包裝盒，購(gòu)于商洛市商州區(qū)客都超市。

1.2 供試菌種

大腸桿菌（Esherichiacoli）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均購(gòu)自西安市長(zhǎng)安區(qū)瑞昇化玻儀器供應(yīng)站。

1.3 方法

1.3.1 五味子乙素的提取與測(cè)定

1）材料預(yù)處理

將南五味子新鮮果實(shí)置于60℃電熱恒溫箱中烘干至恒重，粉碎后過(guò)40目篩，密封備用[10]。

2）五味子乙素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，甲醇定容至50 mL容量瓶?jī)?nèi)，所得五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.2 mg/mL。分別精密吸取0.2 mg/mL的五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL于10 mL容量瓶中，以甲醇定容。

高效液相色譜法檢測(cè)不同濃度五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]。條件為：波長(zhǎng)254 nm、流動(dòng)相為甲醇：水（90：10）、進(jìn)樣量 20 μL、柱溫 25 ℃、流速1.0 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=153118x-86537，R2=0.9995，線性關(guān)系良好。

3）五味子乙素的提取

精確稱取5 g南五味子果實(shí)粉末，按料液比1：8加入85%乙醇溶液，在70℃水浴條件下浸提2 h，提取完成后用抽濾機(jī)抽濾，濾液即南五味子中五味子乙素待測(cè)液。

4）五味子乙素的測(cè)定

精密吸取五味子乙素待測(cè)液30 mL，甲醇定容至100 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液，然后吸取1.0 mL于進(jìn)樣瓶中，檢測(cè)其在254 nm處的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算得到五味子乙素提取率[12]。

5）五味子乙素提取的單因素試驗(yàn)

分別探討乙醇體積分?jǐn)?shù)（75%，80%，85%，90%，95%）、料液比（1：4，1：6，1：8，1：10，1：12（g：mL））、提取溫度（50℃，60℃，70℃，80℃，90℃）及提取時(shí)間（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h），4 個(gè)因素對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響。

6）五味子乙素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

選取單因素試驗(yàn)中對(duì)五味子乙素提取率影響顯著的三個(gè)因素，以單因素試驗(yàn)中各因素的最適合條件為中心點(diǎn)，實(shí)施三因素三水平設(shè)計(jì)，利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行數(shù)學(xué)建模，得到最優(yōu)工藝參數(shù)，見(jiàn)表1。

表1 五味子乙素提取的因素水平表

7）五味子乙素提取的驗(yàn)證試驗(yàn)

按6）優(yōu)化工藝條件，取平行試驗(yàn)中五味子乙素提取率的平均值與預(yù)測(cè)值比較，評(píng)價(jià)模型與試驗(yàn)的擬合程度[13-14]。

1.3.2 五味子乙素的抑菌性

采用胥春霞等[15]的方法對(duì)五味子乙素提取液進(jìn)行分離純化，制備成五味子乙素母液10mg/mL，并配置系列濃度溶液（2.000 0，1.000 0，0.500 0，0.250 0，0.125 0，0.062 5，0.031 3，0 mg/mL） 進(jìn)行五味子乙素抑菌效果試驗(yàn)。應(yīng)用牛津杯法，測(cè)定不同濃度五味子乙素溶液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌三種供試菌種的抑菌效果，將能產(chǎn)生抑菌圈的最低濃度確定為五味子乙素對(duì)該菌的最低抑菌濃度（MIC）[16]。

1.3.3 復(fù)合保鮮劑配方優(yōu)化

1）復(fù)合保鮮劑配方制備的單因素試驗(yàn)

分別探討Vc含量（0.15，0.18，0.21，0.24，0.27 g）、檸檬酸含量（0.36，0.39，0.42，0.45，0.48 g）、黃原膠含量（0.09，0.12，0.15，0.18、0.21 g）及 2 mg/mL五味子乙素溶液的體積（9，10，11，12，13 mL）四個(gè)因素對(duì)復(fù)合保鮮劑保鮮效果的影響。

2）復(fù)合保鮮劑配方的正交試驗(yàn)

采用 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表對(duì)復(fù)合保鮮劑配方進(jìn)行優(yōu)化，見(jiàn)表2。待配制的復(fù)合保鮮劑完全溶解后，將清洗干凈的新鮮雞蛋放入其中浸泡30 s后撈出，晾干形成完整的涂膜，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中加速貯藏，將未涂膜設(shè)為對(duì)照組，每隔5 d檢測(cè)雞蛋的失重率和哈夫單位[17]。

表2 復(fù)合保鮮劑配方的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3.4 復(fù)合保鮮劑的應(yīng)用試驗(yàn)

雞蛋新鮮度的數(shù)據(jù)處理參照田玥等[18]的方法，以雞蛋的失重率、哈夫單位值為試驗(yàn)指標(biāo)。鮮雞蛋的品質(zhì)分級(jí)參照中華人民共和國(guó)國(guó)內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10638－2011《鮮雞蛋、鮮鴨蛋分級(jí)》[19]，見(jiàn)表3。一般情況下，市場(chǎng)上雞蛋的哈夫單位值不低于60，本研究中對(duì)哈夫單位值低于40的雞蛋認(rèn)定為不可食用，其數(shù)據(jù)不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表3 鮮雞蛋的品質(zhì)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

哈夫單位計(jì)算公式：

式中，h為蛋白高度，mm；w為全蛋蛋重，g；HU為哈夫單位，Ha。

2 結(jié)果與分析

2.1 南五味子中五味子乙素提取工藝優(yōu)化

2.1.1 南五味子中五味子乙素提取的單因素試驗(yàn)

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)五味子乙素提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響如圖1所示。

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)由75%提高到90%時(shí)，五味子乙素提取率逐漸增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，提取率達(dá)到最高為1.73 mg/g；而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加提取率逐漸降低。故90%為較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響

2）料液比對(duì)五味子乙素提取率的影響

料液比對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響如圖2所示。由圖2可知，五味子乙素提取率隨著料液比的增加其變化趨勢(shì)為先增加后減少。料液比為1:8時(shí)，五味子乙素提取率最高為1.75 mg/g。可能是由于隨著溶劑量的增大，在較短時(shí)間內(nèi)與大量溶劑充分反應(yīng)，當(dāng)達(dá)到一定程度后大量的溶劑存在影響了整個(gè)體系的傳質(zhì)和傳熱，不利于提取的進(jìn)行。故1:8為較佳的料液比。

圖2 料液比對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響

3）提取溫度對(duì)五味子乙素提取率的影響

提取溫度對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度增高分子運(yùn)動(dòng)速度加快，五味子乙素更易溶出，提取率增大；溫度為70℃時(shí)，提取率最高為1.69 mg/g；當(dāng)提取溫度持續(xù)增高，五味子乙素內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致提取率降低，故最佳提取溫度確定為70℃。

圖3 提取溫度對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響

4）提取時(shí)間對(duì)五味子乙素提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響如圖4所示。由圖4可知，提取時(shí)間逐漸增加，五味子乙素提取率也逐漸增加。提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，五味子乙素提取率達(dá)到最大值1.74 mg/g；之后時(shí)間延續(xù)，五味子乙素提取率反而降低，可能是由于細(xì)胞內(nèi)溫度升高及在空氣中暴露時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生降解或縮合等反應(yīng)引起的。故2.5 h為較佳的提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)南五味子中五味子乙素提取率的影響

2.1.2 南五味子中五味子乙素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

1）南五味子中五味子乙素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、B（料液比）、C（提取時(shí)間）為響應(yīng)面自變量，以五味子乙素提取率為響應(yīng)值，結(jié)果如表4所示。

表4 南五味子中五味子乙素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

對(duì)表4中17組試驗(yàn)所得五味子乙素提取率進(jìn)行響應(yīng)面分析，可得兩兩因素相互交匯的三維曲面圖，見(jiàn)圖5。由圖5（a）可見(jiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著料液比逐漸增加，五味子乙素提取率先升高后降低，料液比為1：7～1：9時(shí)，五味子乙素提取率最大；料液比一定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，五味子乙素提取率先升高后降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為89%～91%時(shí)，五味子乙素提取率最高。結(jié)果表明，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)二者的交互影響對(duì)五味子乙素提取率的影響較大。由圖5（b）可見(jiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，南五味子中五味子乙素提取率先升高后降低，提取時(shí)間為2.4～2.6 h時(shí)，五味子乙素提取率最大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，五味子乙素提取率逐漸降低；提取時(shí)間一定時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，五味子乙素提取率先升高后降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為89%～91%時(shí)五味子乙素提取率最高。結(jié)果表明，乙醇體積、提取時(shí)間二者的交互影響對(duì)五味子乙素提取率的影響較小。

圖5 兩兩因素對(duì)五味子乙素提取率的交互影響

由圖5（c）可見(jiàn)，當(dāng)料液比一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，五味子乙素提取率先增加后降低，提取時(shí)間為2.4～2.6 h時(shí)，五味子乙素提取率最大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，五味子乙素提取率逐漸降低；提取時(shí)間一定時(shí)，隨著料液比的增加，五味子乙素提取率先升高后降低，料液比為1：7～1：9時(shí)五味子乙素提取率最大。結(jié)果表明，料液比、提取時(shí)間二者的交互影響對(duì)五味子乙素提取率的影響較為重要。

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后，南五味子中五味子乙素最佳提取工藝為：料液比1：8.04、乙醇體積分?jǐn)?shù)90.16%、提取時(shí)間2.51 h，模型預(yù)測(cè)提取率為1.782 mg/g。為了便于操作，將優(yōu)化后提取工藝修正為：料液比1：8、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取時(shí)間2.5 h。

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程模型為：R=0.18-2.5×10-4A+2.25×10-3B-1.0×10-3C-2.5×10-4AB+2.25×10-3AC-7.5×10-4BC-5.375×10-3A2-0.012B2-8.875×10-3C2，比較該方程的一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值，可以看出考察的三個(gè)因素對(duì)五味子乙素提取率的影響為：料液比>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)；方程二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，推測(cè)方程具有極大值點(diǎn)，能夠?qū)μ崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化[20]。

回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方程的模型極顯著（P<0.000 1），模型有意義。方程中 A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC 與 BC 對(duì)五味子乙素提取率均具有顯著的影響。模型的失擬項(xiàng)不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6>0.9，R2Adj=0.999 1，表明擬合的回歸方程符合實(shí)際情況，能較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值，此模型可用于對(duì)南五味子果實(shí)中五味子乙素提取率的分析和預(yù)測(cè)。

表5 南五味子中五味子乙素提取的回歸模型系數(shù)的方差分析

2）南五味子中五味子乙素提取的驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明：優(yōu)化工藝條件為料液比1：8、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取時(shí)間2.5 h。據(jù)此最優(yōu)方案進(jìn)行五味子乙素提取，提取率為1.77 mg/g，與預(yù)期值吻合，可以作為最優(yōu)方案。

2.2 南五味子中五味子乙素的抑菌性

由表6可知，南五味子中五味子乙素對(duì)三種供試菌種均有一定的抑制效果，其中大腸桿菌＜沙門(mén)氏菌＜金黃色葡萄球菌。大腸桿菌的MIC為1.00 mg/mL，沙門(mén)氏菌的MIC為0.50 mg/mL，金黃色葡萄球菌的MIC為0.125 mg/mL，說(shuō)明五味子乙素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。

表6 南五味子中五味子乙素的最低抑菌濃度

2.3 復(fù)合保鮮劑配方制備及優(yōu)化

2.3.1 復(fù)合保鮮劑配方的單因素試驗(yàn)

1）Vc含量對(duì)雞蛋保鮮效果的影響

根據(jù)圖6、圖7，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，雞蛋均有一定的失重，其中使用0.27 g Vc的復(fù)合保鮮劑的雞蛋重量減輕較緩，失重率最高為4.8%，比對(duì)照低了3.3%；使用0.21 g Vc的復(fù)合保鮮劑的雞蛋哈夫單位變化較小，在同組試驗(yàn)中較高，為67 Ha。

圖6 不同Vc含量的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋失重率的影響

圖7 不同Vc含量的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋哈夫單位的影響

2）檸檬酸含量對(duì)雞蛋保鮮效果的影響

根據(jù)圖8、圖9，其中使用0.48 g檸檬酸的復(fù)合保鮮劑的雞蛋重量減輕較緩，失重率最高為3.1%，比對(duì)照低5.6%；使用0.45 g檸檬酸的復(fù)合保鮮劑的雞蛋哈夫單位變化較小，在同組試驗(yàn)中較高，為67 Ha。

圖8 不同檸檬酸含量的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋失重率的影響

圖9 不同檸檬酸含量的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋哈夫單位的影響

3）黃原膠含量對(duì)雞蛋保鮮效果的影響

根據(jù)圖10、圖11，其中使用0.21 g黃原膠的復(fù)合保鮮劑的雞蛋重量減輕較緩，失重率最高為4.8%，比對(duì)照低5.1%；使用0.21 g黃原膠的復(fù)合保鮮劑的雞蛋哈夫單位值變化較小，在同組試驗(yàn)中較高，為66 Ha?？赡苁怯捎诟邼舛鹊狞S原膠黏度及穩(wěn)定性較好，能更好地成膜保護(hù)雞蛋。

圖10 不同黃原膠含量的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋失重率的影響

圖11 不同黃原膠含量的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋哈夫單位的影響

4）五味子乙素溶液對(duì)雞蛋保鮮效果的影響

根據(jù)圖12、圖13，使用11 mL五味子乙素溶液的雞蛋重量減輕較緩，失重率最高為3.8%，比對(duì)照低4.2%；使用9 mL五味子乙素溶液的雞蛋哈夫單位變化較小，在同組試驗(yàn)中較高，為80 Ha。

圖12 不同體積的五味子乙素溶液的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋失重率的影響

圖13 不同體積的五味子乙素溶液的復(fù)合保鮮劑對(duì)雞蛋哈夫單位的影響

2.3.2 復(fù)合保鮮劑配方的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定試驗(yàn)指標(biāo)后選出一部分有代表性的水平組合進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表7和表8。

表7 復(fù)合保鮮劑配方的正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表8 復(fù)合保鮮劑配方的正交試驗(yàn)的失重率和哈夫單位的極差分析

由表7和表8可知，正交試驗(yàn)獲得的優(yōu)化復(fù)合保鮮劑配方為E3F2G1H3，即在試驗(yàn)貯藏期（25 d）內(nèi)經(jīng)11 mL，2 mg/mL五味子乙素溶液+0.21 gVc+0.42 g檸檬酸+0.21 g黃原膠用水定容至100 mL處理過(guò)的雞蛋保藏較好。

2.4 復(fù)合保鮮劑的應(yīng)用效果

將制備的復(fù)合保鮮劑應(yīng)用于雞蛋在37℃恒溫加速貯藏25 d，以未處理組為對(duì)照，檢測(cè)評(píng)定感官品質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表9。試驗(yàn)組E3F2G3H3（2 mg/mL五味子乙素溶液11 mL、Vc 0.21 g、檸檬酸0.48 g、黃原膠0.21 g）失重率和蛋白pH顯著低于對(duì)照，哈夫單位為對(duì)照的2.1倍，且蛋殼、蛋黃和蛋白感官質(zhì)量均保持較好，未出現(xiàn)明顯血斑。由此可見(jiàn)，該組合處理在37℃雞蛋加速貯藏中保鮮效果顯著。

表9 37℃加速貯藏后雞蛋感官評(píng)定

3 結(jié)論與討論

基于單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化，得出商洛南五味子中五味子乙素的提取工藝為：提取溫度70 ℃條件下，料液比 1:8（g：mL）、90%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取2.5 h，五味子乙素提取率為1.77 mg/g。李樹(shù)聲等[10]采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇浸提五味子乙素，用高效液相色譜儀測(cè)定其提取率，與微波輔助、乙醇回流、超臨界萃取等方法相比操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力，適于批量提取，可明顯節(jié)約成本。此研究結(jié)果比本研究結(jié)果的五味子乙素提取率稍低一點(diǎn)，而本研究結(jié)果的五味子乙素提取率比陰冠秀等[21]的研究結(jié)果高得多?？赡茉颍阂皇怯捎诓烧衔逦蹲右宜毓麑?shí)不適期，錯(cuò)過(guò)了南五味子中五味子乙素含量最高的時(shí)期，導(dǎo)致部分五味子乙素分解。二是由于粉碎程度不夠小，未能將有效成分全部提取。三是提取時(shí)水浴鍋的溫度控制可能會(huì)有變化，不能保證恒定，造成誤差。

五味子乙素對(duì)供試菌種均有一定的抑菌效果，順序?yàn)椋捍竽c桿菌＜沙門(mén)氏菌＜金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌的MIC為0.125 mg/mL。制備的復(fù)合保鮮劑最優(yōu)配方為：100 mL水溶液中含2 mg/mL五味子乙素溶液11 mL、0.21 g Vc、0.48 g檸檬酸、0.21g黃原膠，將其應(yīng)用于新鮮雞蛋37℃加速貯藏，與空白對(duì)照對(duì)比，失重率明顯降低、哈夫單位變化較小，能延長(zhǎng)貯藏期15 d。試驗(yàn)?zāi)M雞蛋最易受微生物影響腐敗變質(zhì)的溫度，日常貯藏條件會(huì)優(yōu)于試驗(yàn)條件，保藏效果會(huì)更好。

五味子乙素溶液能有效抑制腐敗菌的繁殖，從而延長(zhǎng)食品保質(zhì)期和貨架期，故可作為天然保鮮成分，與其它天然安全的材料復(fù)配生產(chǎn)新型食品保鮮劑。本研究結(jié)果可為商洛南五味子在食品防腐保鮮方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。