姚淑婷，楊 強(qiáng)，趙思雨，王 溥，賀茂芳,b

（西安醫(yī)學(xué)院a.藥學(xué)院；b.藥物研究所，陜西 西安 710021）

早在1849年，荷蘭科學(xué)家Boeseken 等首次發(fā)現(xiàn)了H3BO3與順式二醇類物質(zhì)之間的共價(jià)結(jié)合，同時(shí)，將H3BO3加入到紙色譜展開劑中，實(shí)現(xiàn)了糖類物質(zhì)的分離與檢測(cè)。1970年，Weith 等人將苯硼酸鍵合到纖維素表面用于核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的分離。進(jìn)入21 世紀(jì)以來，硼親和技術(shù)蓬勃發(fā)展，成為分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。

硼親和的作用原理見圖1。

圖1 硼親和的作用原理Fig.1 Principle for boronate affinity technique

硼酸基和順式二羥基在堿性環(huán)境中（pH 值大于8.5）形成五元或六元環(huán)酯，當(dāng)環(huán)境變?yōu)樗嵝詴r(shí)，環(huán)酯解離，從而釋放出順式二羥基分子[2]。該方法有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）選擇性好，操作簡便，條件溫和；（2）酸性洗脫條件有利于離子化，質(zhì)譜兼容性好；（3）對(duì)目標(biāo)物的捕獲和釋放過程是可逆反應(yīng)，不會(huì)破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)；（4）分離富集過程中只需調(diào)節(jié)溶液的pH 值，無需加入其他物質(zhì)，減少了干擾。近年來，形式多種多樣的硼親和材料廣泛應(yīng)用于各種小分子化合物（兒茶酚、核苷類等）和生物大分子（糖蛋白、糖肽）的分離富集和檢測(cè)[3]。本文對(duì)近年來新型硼親和材料的制備方法進(jìn)行了綜述，主要包括點(diǎn)擊化學(xué)法、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法、超支化聚合物修飾法、分子印跡法和整體合成法。

1 硼親和材料的制備方法

1.1 點(diǎn)擊化學(xué)法

點(diǎn)擊化學(xué)是指通過小分子基團(tuán)的拼接，簡單、高效地完成C-X-C 雜原子化學(xué)合成的一類組合化學(xué)方法。目前，最常用的點(diǎn)擊反應(yīng)是銅催化的“疊氮-炔基”環(huán)加成反應(yīng)。此外，還有自由基引發(fā)的“巰-烯/炔”點(diǎn)擊反應(yīng)。點(diǎn)擊反應(yīng)的反應(yīng)效率高、副反應(yīng)少、條件溫和，具有很高的化學(xué)選擇性且不受水氧干擾、環(huán)境污染小[4]。因此，將點(diǎn)擊反應(yīng)用于硼親和材料的制備，可提高硼酸配體的鍵合量，有利于提高材料的吸附容量。例如，張[5]等人將SiO2進(jìn)行疊氮化修飾后，以4-氰基苯硼酸為親和配體，利用點(diǎn)擊反應(yīng)合成了硼親和硅膠吸附劑。該吸附劑成功從過氧化物酶（HRP）和免疫球蛋白G（IgG）酶解液中富集出糖肽，并應(yīng)用于人血清中糖蛋白的富集。Zhang[6]以Fe3O4為基質(zhì)，以4-巰基苯硼酸和3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）為親和配體，利用“巰-烯”點(diǎn)擊化學(xué)法合成了兩種硼親和磁性材料，對(duì)糖蛋白展現(xiàn)出較高的吸附容量和選擇性，對(duì)卵清蛋白（OVA）和轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）的吸附容量分別為899.1、159.2mg·g-1。

1.2 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法

原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法（ATRP）是向材料表面修飾線性聚合物的一種常用方法，廣泛應(yīng)用于抗污染界面、生物傳感界面和分離介質(zhì)的制備[7]。該方法首先將引發(fā)劑鍵合在材料表面，然后引發(fā)單體原位聚合，從而在材料表面生長出線性聚合物刷。通過控制引發(fā)劑的密度和聚合時(shí)間，可有效調(diào)控聚合物刷的接枝密度和鏈長；同時(shí)，聚合物刷的碳-碳骨架靈活，自由度較高。因此，ATRP 法可有效避免聚合物分子間的空間位阻，顯著提高聚合物鏈的接枝密度[8]。近年來，ATRP 技術(shù)被成功應(yīng)用于硼親和吸附劑的制備，從而提高材料的吸附容量[9-11]。例如，衛(wèi)[12]以氧化石墨烯為基質(zhì)、4-乙烯基苯硼酸為單體，通過ATRP 接枝了側(cè)鏈為苯硼酸的聚合物刷。該材料對(duì)OVA 和TRF 的吸附容量分別為514.8，445.9g·g-1。Wang[13]等以氨基化的Fe3O4為基質(zhì)，AAPBA 為單體進(jìn)行ATRP 反應(yīng)，制備了硼親和磁性納米吸附劑，并將其應(yīng)用于生物樣品中糖蛋白分離。該吸附劑對(duì)糖蛋白顯示出良好的吸附選擇性，對(duì)OVA 和TRF 的吸附容量分別為798.1、278.1mg·g-1，而對(duì)非糖蛋白細(xì)胞色素C（Cyt C）、溶菌酶（Lyz）的吸附容量分別為53.7、30.8mg·g-1。本課題組[14]以Fe3O4@SiO2為基質(zhì)、AAPBA 為單體進(jìn)行ATRP 反應(yīng)，得到苯硼酸聚合物鏈修飾的磁性納米材料（Fe3O4@SiO2@pAAPBA）。該材料對(duì)OVA 和辣根過氧化物酶（HRP）的吸附容量分別為373.9、471.3μg·mg-1。最后，將其應(yīng)用于雞蛋清中糖蛋白的分離，獲得了較高的純度。研究表明，ATRP 技術(shù)能有效提高吸附容量主要有兩方面原因[15]：（1）材料表面硼酸配體的密度增高，使材料的吸附位點(diǎn)增多；（2）線性聚合物“分子刷”具有三維納米結(jié)構(gòu)，分子骨架靈活，有利于傳質(zhì)。

1.3 超支化聚合物修飾法

近年來，通過超支化聚合物修飾法提高硼酸配體的鍵合量，從而利用“多位點(diǎn)”協(xié)同吸附提高親和力的研究被陸續(xù)報(bào)道[16,17]。該方法首先將超支化大分子修飾在基質(zhì)表面，然后利用支鏈末端的氨基引入苯硼酸，大量苯硼酸的引入促使吸附劑與多個(gè)糖基化位點(diǎn)發(fā)生協(xié)同吸附，從而提高親和力。例如，Wang 等[18]將樹枝狀大分子聚酰胺（PAMAM）修飾在Fe3O4表面，然后在樹枝分子鏈末端引入高密度的醛基苯硼酸，憑借“多位點(diǎn)”協(xié)同吸附，該吸附劑對(duì)糖蛋白的結(jié)合常數(shù)（Ka）值為105～106M-1，相比于直接鍵合型吸附劑，親和力提高了3～4 個(gè)數(shù)量級(jí)。當(dāng)使用分子骨架靈活性更好、氨基密度更高的聚乙烯亞胺（PEI）代替PAMAM 時(shí)，可將Ka值升高至106～107M-1，親和力進(jìn)一步提高[19]。然而，樹枝狀聚合物目前均采用席夫堿反應(yīng)，使材料表面引入大量氨基，增強(qiáng)了離子作用，使吸附劑的選擇性降低。同時(shí)，由于大分子之間的空間位阻效應(yīng)，聚合物分子的接枝密度有限，使吸附容量降低。

1.4 分子印跡法

分子印跡法一般以目標(biāo)分析物為模板，將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑等混合后在一定條件下進(jìn)行聚合，形成包裹模板分子在內(nèi)的聚合物，然后通過適當(dāng)方式去除模板分子，即得到分子印跡聚合物（MIPs）。MIPs 有著與模板分子三維尺寸和形狀相匹配的印跡空腔，能與模板分子特異性結(jié)合，不僅有著良好的靶向識(shí)別能力，還具有穩(wěn)定性好、制備簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此，廣泛應(yīng)用于分離純化、生物傳感、抗體識(shí)別等領(lǐng)域。但大多數(shù)印跡方法可控性較差，印跡效率不高，且適用于不同模板分子和基質(zhì)的通用型印跡技術(shù)極為有限，因而，一定程度地限制了分子印跡技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[20,21]。

硼親和可控定向表面分子印跡技術(shù)將硼親和作用與分子印跡技術(shù)有效結(jié)合，印跡過程主要通過模板固定、定向印跡和模板移除3 步來實(shí)現(xiàn)[22]。該技術(shù)不僅印跡效率高、通用性好，還具有親和力高、選擇性好、質(zhì)譜兼容性高等優(yōu)點(diǎn)，在順式二羥基生物分子的高效富集方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Sun[23]等以SiO2為核心，通過“硫-烯”點(diǎn)擊反應(yīng)將AAPBA 修飾于SiO2表面，然后利用硼親和作用定向固定模板糖蛋白HRP，最后，通過多巴胺自聚合得到聚多巴胺涂層的分子印跡材料。在最優(yōu)條件下，該材料對(duì)HRP的吸附容量為0.58μmol·g-1，印跡因子為2.6。Luo[24]等以硼酸功能化的氧化石墨烯為基質(zhì)、OVA 為模板分子，然后通過有機(jī)硅烷的“溶膠-凝膠”聚合法在氧化石墨烯表面形成聚合物涂層，最后除去模板分子，則得到與OVA 的三維尺寸和形狀相匹配的3D 印跡空腔。該空腔對(duì)OVA 具有雙重識(shí)別能力，印跡因子達(dá)9.5。由于石墨烯的高比表面積和印跡聚合物的協(xié)同效應(yīng)，該材料對(duì)OVA 的吸附容量在30min 內(nèi)可以達(dá)到278mg·g-1。

1.5 整體合成法

整體合成法是功能單體、交聯(lián)劑等在柱管內(nèi)進(jìn)行原位聚合反應(yīng)，得到具有多孔結(jié)構(gòu)的整體柱材料，具有柱容量高、分離速度快的特點(diǎn)[25,26]。例如，楊等[27]首先以四甲氧基硅烷和巰丙基三甲氧基硅烷作為反應(yīng)單體，采用“溶膠-凝膠”反應(yīng)制備表面含巰基的硅膠整體柱，然后利用“巰-烯”點(diǎn)擊反應(yīng)在整體柱上修飾AAPBA，制成AAPBA-硅膠雜化親和整體柱。在中性和堿性條件下，該整體柱對(duì)OVA 的吸附容量分別為6.5、1.95mg·g-1。Li[28]等用甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、N,N-甲苯丙胺酰胺（MBAA）為單體，通過熱引發(fā)自由基共聚法合成環(huán)氧功能化毛細(xì)管柱基體，再用PEI 修飾基體柱，最后用2,4-二氟-3-甲酰-苯基硼酸進(jìn)行功能化修飾，得到硼親和整體材料，成功應(yīng)用于HPR、RNase B、TRF 混合溶液的富集，吸附容量分別為0.32、0.26、0.26μmol·g-1，該富集過程快速達(dá)到平衡且有較好的選擇性。

2 結(jié)語

硼親和吸附劑的制備方法，直接影響著材料的分離富集能。近年來，硼親和技術(shù)快速發(fā)展，多種多樣的新型修飾方法解決了傳統(tǒng)硼親和材料吸附容量低、親和力弱、適用pH 值范圍窄等問題，顯著改善了硼親和吸附劑的分離富集性能，為提升硼親和技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。