陳舒麗，鄧秋紅，黎威巍，金科華，劉漢才

（湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部，湖北 咸寧 437100）

酶的抑制劑是與酶結(jié)合使酶催化活性降低或消失，但酶分子不發(fā)生變性的一類(lèi)化合物。根據(jù)抑制劑與酶是否共價(jià)結(jié)合，可將酶的抑制作用分為可逆性抑制作用和不可逆性抑制作用[1]。競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用是可逆性抑制作用的一種，即抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)同一酶的活性中心，使底物分子無(wú)法與酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酶的活性。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的相對(duì)親和力和抑制劑與底物濃度的相對(duì)比例[2]。當(dāng)抑制劑濃度不變時(shí)，抑制程度隨底物濃度的增加而減弱，最終可以通過(guò)加大底物濃度，消除競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抑制作用[3]。

丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)里面的一個(gè)研究酶的抑制作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)過(guò)程中一個(gè)重要的酶，能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的2H 由輔基FAD 接受還原成FADH2，然后琥珀酸氧化呼吸鏈將2H 傳遞給氧生成水[4]。丙二酸與琥珀酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似，是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如果有丙二酸存在時(shí)，此酶的活性受到抑制。丙二酸與琥酸脫氫酶的親和力遠(yuǎn)大于琥珀酸本身對(duì)它的親和力，當(dāng)丙二酸濃度僅為琥珀酸濃度的1/50 時(shí)，酶的活性便被抑制50%[5]，因此抑制作用很強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中用甲烯藍(lán)（MB）作為受氫體。在隔絕空氣的條件下,脫下的氫被藍(lán)色的甲烯藍(lán)接受還原成無(wú)色的甲烯白（MBH+H），在總的反應(yīng)體系體積相同時(shí)，通過(guò)觀察甲烯藍(lán)顏色消退的快慢來(lái)衡量反應(yīng)體系內(nèi)部脫氫反應(yīng)的快慢，同時(shí)判斷丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶活性的抑制程度。

該實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)做法實(shí)驗(yàn)結(jié)果欠佳、現(xiàn)象不明顯，從而影響了實(shí)驗(yàn)成功率。為了更有效、經(jīng)濟(jì)地開(kāi)展該實(shí)驗(yàn)，針對(duì)以上實(shí)際問(wèn)題，在以往教學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一些改進(jìn)，并取得了良好的效果。

1 傳統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

手術(shù)剪；玻璃研缽；離心機(jī)；恒溫水箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1/15 mol/L（pH=7.4）磷酸緩沖液；0.2 mol/L 琥珀酸溶液：稱(chēng)取琥珀酸23.62 g，加蒸餾水溶解后定容至1000 mL；0.02 mol/L 丙二酸溶液：稱(chēng)取丙二酸22.92 g，加蒸餾水溶解后定容至1 000 mL；0.01%甲烯藍(lán)溶液；液體石蠟。

所用磷酸鹽、琥珀酸、丙二酸、甲烯藍(lán)等試劑均為市售化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟[6]

取小白鼠一只，頸椎脫臼法處死，取出肝臟，約1.5 g，加入7 mL pH=7.4 磷酸緩沖液，充分研磨至糊狀。將肝勻漿離心，取上清液備用，此即含琥珀酸脫氫酶的肝糜液。取試管5 支，按第8 頁(yè)表1 操作。

將上述各管搖勻，于各管滴加液體石蠟隔絕空氣（第8 頁(yè)圖1），置37℃水浴中保溫，隨時(shí)觀察各管甲烯藍(lán)褪色情況，記錄時(shí)間。

圖1 反應(yīng)前各管顏色

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按表1 操作，重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)第8 頁(yè)圖2（第一支試管完全褪色時(shí)拍攝）。

圖2 各管顏色變化情況

表1 酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用

各管開(kāi)始褪色，時(shí)間見(jiàn)表2，37℃水浴后開(kāi)始計(jì)時(shí)。褪色時(shí)間依次延長(zhǎng)，反應(yīng)最快的第一支試管在水浴20 min 后開(kāi)始褪色。

表2 各試管開(kāi)始褪色時(shí)間

1.5 實(shí)驗(yàn)分析

隨著抑制劑濃度的增大，酶的活性逐步降低，5支試管褪色時(shí)間依次延長(zhǎng)，與理論分析相一致。

1.6 實(shí)驗(yàn)缺陷

在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于未將琥珀酸和丙二酸溶液的pH 調(diào)至7.4，因此在各試管中加入了pH=7.4的磷酸緩沖液來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH 及整個(gè)反應(yīng)體系的體積。但是加入磷酸緩沖液后，各個(gè)試管的pH 不盡相同且偏低。經(jīng)測(cè)定，5 支試管的pH 分別為6.3、6.1、6.6、6.4、和6.9。pH 不同，導(dǎo)致酶的催化活性不同；pH 偏低，導(dǎo)致酶的活性下降。而且由于磷酸緩沖液加入體積較大，導(dǎo)致肝糜液中酶的濃度降低，所以催化速度較慢，各試管褪色時(shí)間較長(zhǎng)。盡管試管1 中未加抑制劑，但退色完全時(shí)仍長(zhǎng)達(dá)20 min。長(zhǎng)時(shí)間觀察，容易產(chǎn)生視覺(jué)疲勞，且更易產(chǎn)生煩躁情緒，不利于實(shí)驗(yàn)的開(kāi)出。

2 競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

2.1 實(shí)驗(yàn)器材

實(shí)驗(yàn)器材同1.1。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1/15 mol/L（pH=7.4）磷酸緩沖液；0.2 mol/L 琥珀酸溶液（pH=7.4）：稱(chēng)取琥珀酸23.62 g 加蒸餾水600 mL，用5 mol/L NaOH 調(diào)pH 至7.4，再加蒸餾水至1000 mL；0.02 mol/L 琥珀酸溶液（pH=7.4）：0.2 mol/L琥珀酸溶液（pH=7.4）稀釋10 倍；0.2 mol/L 丙二酸溶液（pH=7.4）：稱(chēng)取丙二酸22.92 g，加蒸餾水600 mL；用5mol/LNaOH 調(diào)pH 至7.4，再加蒸餾水至1000mL；0.02 mol/L 丙二酸溶液（pH=7.4）：0.2 mol/L 丙二酸溶液（pH=7.4）稀釋10 倍；0.01%甲烯藍(lán)溶液；液體石蠟。

所用磷酸鹽、琥珀酸、丙二酸、甲烯藍(lán)等試劑，均為市售化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2.3 改進(jìn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)的過(guò)程

肝糜液的制備同1.3。取試管5 支，按表3 操作。

表3 改進(jìn)的酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用

將各管搖勻，加石蠟封住液面（圖3），放入37℃水浴保溫，記錄時(shí)間。

圖3 反應(yīng)前各管顏色

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按表3 操作，重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)第9 頁(yè)圖4（第一支試管完全褪色時(shí)拍攝）。從圖4 中可以看到，5 支試管依次褪色，梯度明顯。1 號(hào)試管藍(lán)色完全褪去；2 號(hào)試管還有少許藍(lán)色；3、4、5 褪色逐漸減少，顏色越來(lái)越深。

圖4 各管顏色變化

各管開(kāi)始褪色時(shí)間見(jiàn)第9 頁(yè)表4（37℃水浴后開(kāi)始計(jì)時(shí)）。褪色時(shí)間依次延長(zhǎng)，反應(yīng)最慢的第5 支試管在水浴后15 min 開(kāi)始褪色。

表4 各試管開(kāi)始褪色時(shí)間

2.5 實(shí)驗(yàn)分析

隨著抑制劑濃度的增大，酶的活性逐步降低，5支試管褪色時(shí)間依次延長(zhǎng)，與理論分析一致。與改進(jìn)前相比較，時(shí)間縮短了近20 min。改進(jìn)前及改進(jìn)后統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如第9 頁(yè)圖5，可以看出改進(jìn)前后時(shí)間變化具有明顯的差異性。

圖5 改進(jìn)前、后各管褪色時(shí)間

3 討論

在改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，第一個(gè)改進(jìn)是將琥珀酸和丙二酸溶液的pH 調(diào)至7.4，這樣就使整個(gè)反應(yīng)體系的酸堿度維持在pH=7.4，使酶在最適pH 下進(jìn)行催化，保證了酶的最高活性，因此各管反應(yīng)速度明顯增快，褪色時(shí)間變短，每支試管開(kāi)始褪色時(shí)間都比原來(lái)提前了將近20 min。此項(xiàng)改進(jìn)將實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短，學(xué)生不易產(chǎn)生視覺(jué)疲勞和煩躁情緒，有利于實(shí)驗(yàn)的開(kāi)出。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的第二個(gè)改進(jìn)是將肝糜液的加入量減少，由原來(lái)的1.0 mL減至0.5 mL。經(jīng)筆者反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用0.5 mL的肝糜液就可將甲烯藍(lán)完全還原，溶液由藍(lán)色變成肉紅色。在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中，一只小鼠只能供一組實(shí)驗(yàn)使用，經(jīng)過(guò)改進(jìn)，一只小鼠可以供兩組實(shí)驗(yàn)使用。此項(xiàng)改進(jìn)既節(jié)省了原材料和試劑的用量，又減少了經(jīng)費(fèi)的支出，同時(shí)培養(yǎng)了學(xué)生節(jié)約的意識(shí)。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的第三個(gè)改進(jìn)是加大了底物與抑制劑的濃度比。丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的親和力較大，當(dāng)丙二酸濃度僅為琥珀酸濃度的1/50 時(shí)，酶的活性便被抑制50%。在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中，第2、3、4 試管中琥珀酸與丙二酸的濃度比分別為20∶1、10∶1 和5∶1，在改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)中，濃度比分別為10∶1、1∶1 和1∶10。二者的濃度比達(dá)到1∶10 時(shí)，也能觀察到抑制作用，更好地體現(xiàn)了丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制作用。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的第四個(gè)改進(jìn)是將甲烯藍(lán)定量，由4滴改為0.2 mL。由于滴管口徑大小不同，每一滴的量也不同。加入不同量的甲烯藍(lán)，可能會(huì)導(dǎo)致各試管褪色時(shí)間產(chǎn)生較大誤差。經(jīng)筆者反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)0.2 mL比較合適，不僅可以完全接受琥珀酸脫下的氫，而且也不存在過(guò)量問(wèn)題，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后，各試管均能褪色。

另外，第5 支試管沒(méi)有底物，理論上不褪色，為何經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后也開(kāi)始褪色（如圖6）。筆者認(rèn)為是由于肝臟里面存在一定量的琥珀酸和其他的脫氫反應(yīng)。由于肝臟是從活體組織取出，且所處體系pH=7.4，跟體內(nèi)環(huán)境相差不大，所以細(xì)胞內(nèi)的一些代謝活動(dòng)仍在進(jìn)行。因此第5 支試管即使不加底物，最終也會(huì)褪色。至于要加多少丙二酸才能完全抑制酶的活性，溶液不會(huì)褪色，筆者同樣進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)0.2 mol/L 丙二酸加至1 mL，即丙二酸濃度達(dá)到0.1 mol/L 時(shí)，溶液便不再褪色。

圖6 反應(yīng)完畢各試管褪色情況

4 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化，丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的實(shí)驗(yàn)教學(xué)取得了良好的效果。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更加科學(xué)化、合理化，實(shí)驗(yàn)成本減小，實(shí)驗(yàn)成功率也得以提高。