趙 寧,李偉澤,付麗娜,王小寧,馬 秀,任菲菲

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

表柔比星(Epirubicin hydrochloride，EPI)為蒽醌類抗腫瘤藥，具有廣譜、高效的特點，主要用于乳腺癌、惡性淋巴瘤、軟組織肉瘤和胃癌等的治療。因表柔比星原藥在外部環(huán)境下不穩(wěn)定,市售表柔比星一般以其鹽酸鹽形式存在。EPI對不同生長周期的細(xì)胞均可產(chǎn)生抑制DNA、RNA和蛋白合成的細(xì)胞毒作用。目前中國使用的劑型以凍干粉和水針劑為主，但常規(guī)制劑存在靶向性差的弊端，不能選擇性地區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞,不良反應(yīng)較多，存在嚴(yán)重的心臟毒性和骨髓抑制作用。其次，透生物膜能力差，生物利用度低，這些缺點一定程度限制了其臨床應(yīng)用[1-2]。

固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles,SLNs)是一種新型的實體骨架微粒給藥系統(tǒng)，粒徑約為20～1 000 nm。通常以室溫下固態(tài)的天然或合成的脂質(zhì)、類脂為基質(zhì)，將藥物包裹于類脂核中，與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體相比，有效解決了藥物容易泄漏的缺點，同時也避免了載體的物理不穩(wěn)定性。因其所用基質(zhì)多為人體耐受性良好的脂質(zhì)材料，具有良好生物相容性和生物可降解性，且能有效提高藥物的生物利用度，增加藥物在體內(nèi)的吸收和靶向性，延緩藥物釋放。同時SLNs成本低，利于大規(guī)模生產(chǎn)，目前已成為微乳、脂質(zhì)體、聚合物納米粒等的替代品[3-5]，因此具有良好應(yīng)用前景。作者研究了以復(fù)乳法制備EPI-SLNs的處方及成型工藝，并考察了EPI-SLNs體外釋藥及透黏膜行為。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

鹽酸表柔比星原料藥：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司；鹽酸表柔比星標(biāo)準(zhǔn)品：批號130560-200501，中國食品藥品檢定研究院；大豆卵磷脂：上海太偉藥業(yè)有限公司；單硬脂酸甘油酯、硬脂酸：南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司；普朗尼克F-68：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；膽固醇：安徽科寶生物工程有限公司；膽酸鈉：東京化成工業(yè)株式會社；聚氧乙烯40單硬脂酸酯：江蘇省海安石油化工廠；色譜乙腈、色譜甲醇：美國Honeywell；其他試劑均為分析純，市售；水：雙蒸水，自制。

高效液相色譜儀：Agilent1260，美國安捷倫科技有限公司；掃描電鏡：ZEISS Gemini 300，德國蔡司公司；透射電鏡：JEM-2100F，日本電子株式會社；激光粒度儀：ZEN-3600，英國馬爾文公司；離心機：Allegra 64R Centrifuge，美國BECKMAN公司；分析天平：Quintix224-1CNsartorius，賽多斯科學(xué)儀器北京有限公司；高速分散勻質(zhì)機：FJ-200，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPI含量測定方法的建立

采用高效液相色譜儀，在色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(水)=37∶63，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為233 nm，進(jìn)樣量為20 μL的色譜條件下，對制劑中EPI含量進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行方法學(xué)考察[6]。

1.2.2 EPI-SLNs的包封率測定方法

采用冷凍高速離心法測定包封率，精密吸取制好的EPI-SLNs 2 mL,經(jīng)高速冷凍離心機，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心60 min，取上清液1 mL置于2 mL容量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液20 μL，測定游離EPI藥量，包封率計算見式(1)。

(1)

1.2.3 EPI-SLNs的制備

(1)制備方法。制備固體脂質(zhì)納米粒的方法較多，有復(fù)乳法、微乳超聲法、高速勻質(zhì)法等，經(jīng)前期預(yù)實驗篩選，以復(fù)乳法所得固體脂質(zhì)納米粒粒徑、電位及包封率較好，因此實驗以復(fù)乳法制備表柔比星固體脂質(zhì)納米粒。具體制備步驟如下。稱取11 mg單硬脂酸甘油、3.5 mg大豆卵磷脂置于25 mL燒杯中加入3 mL乙酸乙酯作為油相，稱取1 mg EPI、5 mg膽酸鈉溶于適量的蒸餾水中作為水相，油相、水相分別置于70 ℃水浴中，使其溶解，后將水相緩慢加入油相，渦旋30 s，超聲20 s使其形成W/O型初乳，再加入8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%泊洛沙姆188和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%賣澤-52中超聲90 s得W/O/W復(fù)乳，將復(fù)乳分散到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%泊洛沙姆188的4 mL水溶液中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，即得。

(2)EPI-SLNs的處方優(yōu)化。藥物包封率是衡量SLNs制劑質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)，也是其能夠發(fā)揮較普通制劑高效、低毒的關(guān)鍵。以SLNs的包封率為評價指標(biāo)，考察在制備過程中m(單硬脂酸甘油酯)(2、3.5、5、8、11 g)，m(大豆卵磷脂)(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mg)，V(油相)∶V(水相)(2、3、4、5、6)對EPI-SLNs包封率的影響。

(3)EPI-SLNs的工藝優(yōu)化。乳化過程對EPI-SLNs的成型至關(guān)重要，考察了制備過程中初乳的渦旋時間(20、30、40、50、60 s)、初乳超聲時間(10、20、30、40、50 s)與復(fù)乳超聲時間(30、60、90、120、150 s)對EPI-SLNs包封率的影響[7-11]。

1.2.4 EPI-SLNs藥劑學(xué)性質(zhì)考察

(1)包封率測定。按照上述篩選的最優(yōu)處方及最佳工藝制備3批EPI-SLNs，其外觀均勻一致，t=4 ℃存放，備用。按1.2.2方法測定其包封率。

(2)粒徑及電位測定。將按最優(yōu)處方和工藝制備的EPI-SLNs適量，置于50 mL燒杯中，按照V(EPI-SLNs)∶V(純凈水)=1∶10稀釋，經(jīng)馬爾文激光粒度儀測定其粒徑及電位[12-14]。

1.2.5 EPI-SLNs的體外釋藥行為考察

采用平衡透析法考察EPI-SLNs的體外釋放特性。取所制備的EPI-SLNs混懸液10 mL置于經(jīng)處理的透析袋中，兩端扎緊，置于50 mL的生理鹽水中，于恒溫磁力攪拌器上，設(shè)定t=37 ℃、n=450 r/min，分別在t=0、1、2、4、8、12、24 h取樣1 mL并及時補充等量的生理鹽水，樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，經(jīng)HPLC檢測，計算EPI的累積釋藥量。以藥物累積釋放率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，同法以EPI水溶液為對照[15]。

1.2.6 EPI-SLNs的體外透黏膜行為考察

采用立式擴散池法考察EPI-SLNs的體外透黏膜行為，具體操作如下。將處理好的豬小腸固定于接收池和供給池之間，黏膜側(cè)面向供給池，供給池中加入所制備的EPI-SLNs，接收池中以7.0 mL的生理鹽水作為接收液。分別在給藥后t=1、2、4、8、12、24、36 h分別精密吸取接收液1.0 mL，并補加等量的新鮮生理鹽水，樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL注入HPLC測定EPI的含量。以EPI水溶液作為對照組，同法操作。各時間點的藥物累積透過率見式(2)。以累積透過率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖[16-17]。

(2)

式中：Q為藥物累計釋放質(zhì)量占總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù),%；ρi為第i次所取樣品的質(zhì)量濃度，mg/L；V為釋放介質(zhì)總體積，mL；Vi為取樣體積，mL；m為藥物總質(zhì)量，mg。

1.2.7 EPI-SLNs的黏膜滯留量考察

在透黏膜實驗36 h后，將腸黏膜取下，晾干后稱量并剪碎，置于燒杯中，加入8 mL生理鹽水，超聲30 min，移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，轉(zhuǎn)移至離心管中，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心30 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜后，經(jīng)HPLC測量黏膜中滯留藥物的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 EPI含量測定的方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取EPI標(biāo)準(zhǔn)品1.000 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得20 μg/mL的EPI儲備液，備用。精密吸取儲備液0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5 mL分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為7.8、15.6、31.2、62.4、125、250、500 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別標(biāo)為1～7號，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜，取20 μL，按照1.2.1色譜條件測定,以峰面積A為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=61.415x+90.228，R2=0.999 2，表明ρ(鹽酸表柔比星)=7.8～500 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.2 方法學(xué)考察

(1)精密度實驗。取EPI 3號標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL，按1.2.1色譜條件測定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察精密度，結(jié)果峰面積積分值的RSD為0.2%，精密度良好(n=6)。

(2)穩(wěn)定性實驗。取EPI 4號標(biāo)準(zhǔn)品溶液室溫下放置，分別于t=0、3、6、12、24、48 h取20 μL注入HPLC，按照1.2.1色譜條件測定其峰面積，峰面積積分值的RSD為0.02%，表明鹽酸表柔比星在t<48 h穩(wěn)定性良好。

(3)重復(fù)性實驗。精密吸取制好的EPI-SLNs 2 mL,置于2 mL離心管，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心60 min，取上清液1 mL置于2 mL容量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL按照1.2.1色譜條件測定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察重復(fù)性，結(jié)果峰面積積分值的RSD為1.61%，重復(fù)性良好(n=6)。

(4)回收率實驗。取9份空白固體脂質(zhì)納米粒1 mL，置于2 mL離心管內(nèi)，分為3組，分別加入62.5、125 L、250 μg/mL EPI標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，t=10 ℃、n=13 500 r/min離心30 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)HPLC按照1.2.1色譜條件測定，測得平均回收率為98.8%，峰面積積分值的RSD為2.91%。

2.2 EPI-SLNs的處方及工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 EPI-SLNs的處方優(yōu)化結(jié)果

單硬脂酸甘油酯是制備SLNs的主要脂質(zhì)材料，其用量對SLNs的質(zhì)量具有重要影響，見圖1(n=3)。

m(單硬脂酸甘油酯)/mg

由圖1可知，當(dāng)m(單硬脂酸甘油酯)=5 mg，EPI-SLNs的包封率為62.5%，此后包封率隨著m(單硬脂酸甘油酯)增加而降低；推測原因可能為在SLNs的制備過程中，藥物與脂質(zhì)存在一定的容納比例，因此通過增大脂質(zhì)材料的用量，提高納米粒對藥物的包封率具有一定限度，且在制備中發(fā)現(xiàn)當(dāng)處方中m(單硬脂酸甘油酯)過大，形成的SLNs混懸液中存在脂質(zhì)析出的現(xiàn)象。

大豆卵磷脂對于初乳的形成至關(guān)重要，影響到SLNs的成型性及包封率，見圖2(n=3)。

m(大豆卵磷脂)/mg

由圖2可知，隨著m(大豆卵磷脂)的增加，EPI-SLNs的包封率呈現(xiàn)先上升后緩慢降低的趨勢，m(大豆卵磷脂)=3.5 mg，包封率達(dá)到最大為65.9%，推測當(dāng)m(大豆卵磷脂)較小時，不能夠完全乳化硬脂酸甘油酯，故包封率較小，m(大豆卵磷脂)=3.5 mg，體系中磷脂已足夠乳化油相，形成穩(wěn)定的初乳，因此當(dāng)m(大豆卵磷脂)繼續(xù)增大，包封率不再明顯增大，且當(dāng)體系中大豆卵磷脂濃度過大，可能形成較多的大小不一的磷脂囊泡，也將影響SLNs的質(zhì)量及外觀形態(tài)。

研究表明，當(dāng)油相組成、載體材料濃度確定后，V(油相)∶V(內(nèi)水相)也會影響SLNs的包封率，見圖3(n=3)。

V(油相)∶V(內(nèi)水相)

由圖3可知，EPI-SLNs的包封率隨著V(油相)∶V(內(nèi)水相)的增加呈先上升后下降的現(xiàn)象，當(dāng)V(油相)∶V(內(nèi)水相)=5，包封率達(dá)到最大為66.7%，在實驗中也發(fā)現(xiàn)當(dāng)V(油相)∶V(內(nèi)水相)較小時，制得的SLNs易膠凝，當(dāng)V(油相)∶V(內(nèi)水相)過大時，制得的SLNs混懸液有藥物結(jié)晶析出。

2.2.2 EPI-SLNs的工藝優(yōu)化結(jié)果

乳化過程對EPI-SLNs的成型至關(guān)重要。考察了制備過程中初乳的渦旋時間、初乳超聲時間與復(fù)乳超聲時間對EPI-SLNs包封率的影響，結(jié)果見圖4～圖6(n=3)。

初乳渦旋時間/s

由圖4可知，制備初乳時，渦旋30 s，SLNs包封率為69.3%，之后隨著渦旋時間的延長，包封率下降，推測原因為渦旋是將體系快速混合，為乳化的準(zhǔn)備步驟，其所提供的能量不足以形成均勻穩(wěn)定的乳劑，因此渦旋時間過長，導(dǎo)致體系中油相、內(nèi)水相的不完全乳化將不利于后續(xù)操作。

由圖5可知，初乳超聲時間為40 s，SLNs包封率為69.5%，繼續(xù)延長超聲時間，包封率下降，推測原因為超聲40 s時初乳已形成，此時體系中乳滴密度較大，繼續(xù)提供較大能量將導(dǎo)致乳滴的碰撞、合并，影響藥物包封率。

初乳超聲時間/s

由圖6可知，復(fù)乳超聲時間為60 s，SLNs包封率為72.3%，繼續(xù)延長超聲時間，包封率降低，推測原因為此時復(fù)乳已經(jīng)形成，若超聲時間過長，將易破壞復(fù)乳結(jié)構(gòu)，引起內(nèi)水相的外溢，因此影響包封率。

復(fù)乳超聲時間/s

綜上，得到最佳制備處方及工藝為m(單硬脂酸甘油酯)=5 mg、m(大豆卵磷脂)=3.5 mg，V(油相)∶V(內(nèi)水相)=5，初乳渦旋時間30 s，初乳超聲時間40 s，復(fù)乳超聲時間60 s。

2.3 EPI-SLNs藥劑學(xué)性質(zhì)考察結(jié)果

2.3.1 EPI-SLNs的包封率

按照篩選的最優(yōu)處方及最佳工藝制備3批EPI-SLNs，其外觀均勻一致，t=4 ℃存放、備用。測定其包封率，結(jié)果見表1。

表1 包封率測定結(jié)果

2.3.2 EPI-SLNs的粒徑及電位

取最優(yōu)處方和工藝制備的EPI-SLNs適量，置于50 mL燒杯中，按V(EPI-SLNs)∶V(純凈水)=1∶10稀釋，經(jīng)馬爾文激光粒度儀測定，其平均粒徑為148.6 nm，粒徑PDI為0.259。粒徑分布均勻，平均電位為-30.8 mV，一般而言，當(dāng)粒子表面電位的絕對值大于30 mV時，由于粒子表面存在大量凈電荷，納米粒子之間存在較大的靜電斥力而有利于制劑的穩(wěn)定性，見圖7、圖8。

d/nm

U/mV

2.4 EPI-SLNs的體外釋藥行為考察結(jié)果

采用平衡透析法考察EPI-SLNs的體外釋放特性，見圖9(n=3)。

t/h

由圖9可知，t=8 h EPI水溶液的釋放度已達(dá)90%，高于EPI-SLNs，EPI-SLNs呈現(xiàn)明顯的緩釋作用。EPI-SLNs的體外釋藥在初期存在突釋現(xiàn)象，t=1 h體外累積釋放度達(dá)到了20.17%，t=4 h為45.02%，推測該階段釋放較快與藥物在SLNs中的分布有關(guān)，在EPI-SLNs的制備中，部分藥物可能以分子或細(xì)小粒子形式分布于納米粒骨架結(jié)構(gòu)的表層或淺表層，而未進(jìn)入內(nèi)核，這些藥物用藥可較快釋放，表現(xiàn)為突釋。此后EPI釋放逐漸緩慢，t=8 h累積釋放度達(dá)65.02%，該階段主要是脂質(zhì)基質(zhì)逐漸被釋放介質(zhì)溶蝕，藥物則通過擴散緩慢從剛性基質(zhì)結(jié)構(gòu)中釋放，故顯示明顯的緩釋。

2.5 EPI-SLNs的體外透黏膜行為考察結(jié)果

采用立式擴散池法考察EPI-SLNs的體外透黏膜行為，見圖10(n=3)。

由圖10可知，EPI-SLNs與其水溶液相比黏膜滲透能力具有明顯優(yōu)勢，t=8、12、36 h，EPI-SLNs的黏膜累積透過率分別為48.4%、55.12%、62.08%，為EPI水溶液的2、1.96、1.79倍，表明EPI-SLNs具有更好的黏膜透過性，因此可推測制備成EPI-SLNs后大大提高了其黏膜滲透能力，有利于藥物在體內(nèi)的吸收，在一定程度上可提高EPI的生物利用度。

t/h

2.6 EPI-SLNs的黏膜滯留量考察

透黏膜實驗進(jìn)行36 h后，將腸黏膜取下，按1.2.6方法測量黏膜中滯留的藥物含量，見圖11(n=3)。

圖11 EPI、EPI-SLNs黏膜滯留率

由圖11可知，36 h后EPI-SLNs和EPI水溶液的的黏膜滯留量分別為給藥量的6.97%和13.84%。結(jié)合透黏膜行為可知，EPI-SLNs比EPI水溶液更易透過黏膜，而不易在黏膜組織中滯留，在一定程度上可推測EPI-SLNs體內(nèi)用藥將更利于吸收而毒副作用更小。

3 結(jié) 論

制備SLNs常用的脂質(zhì)材料有單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、棕櫚酸、膽固醇等，作者在前期預(yù)實驗中對脂質(zhì)材料進(jìn)行了篩選，通過復(fù)乳法，以包封率為指標(biāo)，分別以上述4種材料制備了EPI-SLNs，所得EPI-SLNs包封率分別為59.5%、49.3%、53.8%、55.2%，且以硬脂酸及棕櫚酸為脂質(zhì)材料制備的SLNs混懸液中常出現(xiàn)載體析出的現(xiàn)象，考慮其包封率較低與載體析出及脂質(zhì)膠凝有關(guān)，故實驗以單硬脂酸甘油酯為制備SLNs的主要脂質(zhì)材料。SLNs為納米級別給藥體系，為了得到納米級別的粒子，制備過程中需要給予足夠的能量，將脂質(zhì)材料有效的分散，通常采用超聲或高速攪拌。采用復(fù)乳法制備了EPI-SLNs，體外釋藥行為顯示EPI-SLNs具有明顯的緩釋效果，體外透黏膜實驗顯示EPI-SLNs相較于其水溶液具有更強的黏膜滲透能力，因此，在一定程度上可預(yù)測EPI-SLNs相較于傳統(tǒng)制劑，在體內(nèi)發(fā)揮藥效更加持久，且更有利于藥物的吸收以及生物利用度的提高，因此EPI-SLNs具有廣闊的應(yīng)用前景。