劉少靜，沈晶晶，盧 穎,2，王娜娜,2，張怡心,2，張德柱，秦 蓓,2**

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安710021；2.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，四川 成都 610500；3.陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 西安 710025)

石榴(PunicagranatumL.)屬石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)植物，具有悠久的栽培歷史和豐富的資源[1-2]。西安臨潼是中國石榴的主要產(chǎn)地，截至2017年，臨潼區(qū)石榴的栽植面積達(dá)到8 500 hm2，產(chǎn)量約10萬t[3-5]。石榴具有極高的營養(yǎng)價值及醫(yī)用保健功能，可治久瀉、久痢、脫肛、帶下、蟲積腹痛、疥癬、中耳炎、創(chuàng)傷性出血等癥[6-7]。在中國古代的《名醫(yī)別錄》、《本草綱目》、《滇南本草》、《南寧市藥物志》等藥典中均有關(guān)于石榴藥用的記載。文獻(xiàn)資料表明石榴化學(xué)成分以酚類物質(zhì)、類黃酮物質(zhì)、鞣花單寧等為主；具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)免疫力等廣泛藥理活性[8-10]。其中沒食子酸(GA)是石榴中主要的酚類物質(zhì)之一，是可水解鞣質(zhì)的組成部分，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[11]。

綠原酸(CA)、丹皮酚(Pae)均為經(jīng)典的酚類化合物，能夠有效清除自由基，具備抗氧化、抗衰老等生理活性[12-13]。近年對國內(nèi)國際功能因子尤其是天然功能因子的關(guān)注中，2種以上主要功能因子直接協(xié)同增效的復(fù)配形式已成為研究的主流。研究證明，多種抗氧化功效因子聯(lián)合使用比單一組分具有更好的抗氧化效果[14]。作者分析了Pae、CA、GA的協(xié)同抗氧化作用，為酚類物質(zhì)復(fù)配抗氧化劑開發(fā)提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Pae、CA、GA：純度≥98%，中國藥品生物制品檢定研究院；抗壞血酸(Vc)、二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+·)：阿拉丁試劑(上海)有限公司；無水乙醇等其他試劑均為分析純，市售。

分析天平：AX224ZH，奧豪斯儀器(常州)有限公司；自動全波長酶標(biāo)儀：Multiskan FC，渦旋振蕩器：Maxi Mix Ⅱ，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

(1)復(fù)配樣品的制備。按照質(zhì)量比1∶1分別配置復(fù)配產(chǎn)品Pae-CA、Pae-GA、CA-GA；按照質(zhì)量比1∶1∶1配置復(fù)配產(chǎn)品Pae-CA-GA。

(2)樣品溶液的制備。稱取Pae、CA、GA、Vc及復(fù)配產(chǎn)品各約10 mg，置于相應(yīng)容量瓶中，分別用無水乙醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的母液。采用無水乙醇稀釋成系列質(zhì)量濃度(100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL)，t=4 ℃冷藏，備用。

1.2.2 DPPH·清除能力測定

將100 μL不同質(zhì)量濃度受試物與100 μL DPPH·溶液充分混合，室溫避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定吸光度，作為系列樣品溶液反應(yīng)后Ar；以無水乙醇代替DPPH·溶液進(jìn)行反應(yīng)，于波長517 nm處測定樣品底液吸光度Ax；以無水乙醇代替樣品溶液，于波長517 nm測定吸光度，得到空白對照(Ac)。DPPH·的清除率見公式(1)。依據(jù)系列質(zhì)量濃度樣品溶液清除率，繪制ρ(樣品溶液)-DPHH·清除率曲線，計(jì)算半數(shù)清除率IC50值。

(1)

1.2.3 ABTS+·清除能力測量

配置ABTS+·溶液，將50 μL不同質(zhì)量濃度受試物與150 μL ABTS+·溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于波長734 nm處測定吸光度，作為系列樣品溶液反應(yīng)后Ar；以無水乙醇代替ABTS+·溶液進(jìn)行反應(yīng)，于波長734 nm處測定樣品底液吸光度Ax；以無水乙醇代替樣品溶液，于波長734 nm處測定吸光度，得到空白對照(Ac)。樣品溶液對ABTS+·的清除率見公式(2)。依據(jù)系列質(zhì)量濃度樣品溶液清除率，繪制ρ(樣品溶液)-ABTS+·清除率曲線，計(jì)算半數(shù)清除率IC50值。

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 Pae、CA、GA的自由基清除特性

各受試物DPPH·及ABTS+·清除特性見圖1與圖2。

ρ/(μg·mL-1)

ρ/(μg·mL-1)

由圖1可知，Pae、CA、GA均對DPPH·有一定的清除作用，且清除能力隨著ρ(受試物)增加而逐漸升高，但達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，部分樣品清除DPPH·的能力增長緩慢。ρ(受試物)=50 μg/mL，CA、GA及Vc的清除率趨于平衡。其中GA清除DPPH·的能力在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(3.125～12.5 μg/mL)高于陽性對照Vc。根據(jù)曲線擬合結(jié)果，Pae、CA、GA及Vc的IC50值分別為>100、10.20、3.02、5.45 μg/mL。清除能力依次為GA>Vc>CA>Pae。

由圖2可知，Pae、CA、GA均對ABTS+·有一定的清除作用，隨著ρ(受試物)增加，自由基清除率也逐漸升高，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，部分樣品清除能力趨于平衡。ρ(受試物)=25 μg/mL，GA及Vc的清除率不再升高。GA清除ABTS+·能力在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(3.125～12.5 μg/mL)高于陽性對照Vc。根據(jù)曲線擬合結(jié)果，Pae、CA、GA及Vc的IC50值分別為>50、24.99、4.25、8.90 μg/mL。清除能力依次為GA>Vc>CA>Pae。

2.2 復(fù)配物的自由基清除特性

各復(fù)配物DPPH·與ABTS+·清除特性見圖3、圖4。

ρ/(μg·mL-1)

ρ/(μg·mL-1)

由圖3可知，復(fù)配產(chǎn)品Pae-CA、Pae-GA、CA-GA及Pae-CA-GA均對DPPH·有一定的清除作用，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品的清除能力隨著ρ(受試物)增加而逐漸升高；達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，部分樣品DPPH·的清除能力趨于穩(wěn)定。ρ(受試物)=25 μg/mL，Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的清除率幾乎不再變化。根據(jù)曲線擬合結(jié)果，Pae-CA、Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的IC50值分別為32.60、5.06、2.98、6.03、5.74 μg/mL。清除能力依次為CA-GA>Pae-GA>Vc>Pae-CA-GA>Pae-CA。

由圖4可知，復(fù)配產(chǎn)品Pae-CA、Pae-GA、CA-GA及Pae-CA-GA均對ABTS+·有一定的清除作用，隨著ρ(受試物)增加，自由基清除率也逐漸升高，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，部分樣品清除能力趨于平衡。ρ(受試物)=25 μg/mL，Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的清除率不再升高。根據(jù)曲線擬合結(jié)果，Pae-GA、CA-GA、Pae-CA-GA及Vc的IC50值分別為>50、8.01、4.49、9.60、8.19 μg/mL。清除能力依次為CA-GA>Pae-GA>Pae-CA-GA>Pae-CA。

3 結(jié) 論

Pae、CA、GA在DPPH·、ABTS+·模型中均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，依次為GA>CA>Pae。將三者按照一定比例進(jìn)行復(fù)配，得到4種復(fù)配產(chǎn)品，經(jīng)DPPH·、ABTS+·模型分析，4種產(chǎn)品均具有良好的抗氧化能力，依次為CA-GA>Pae-GA>Pae-CA-GA>Pae-CA。研究表明Pae、CA、GA具有一定的協(xié)同抗氧化作用，這將為酚類物質(zhì)復(fù)配抗氧化劑開發(fā)提供理論參考。