成 昭，張翊娟，程詩雅

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 護理學(xué)院,陜西 西安 710021)

人工合成材料的化學(xué)修飾與功能復(fù)合，是材料研發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域的難點。人工材料的合成線路設(shè)計與合成條件優(yōu)化可從兩方面進行[1-2]：一方面調(diào)控材料結(jié)構(gòu)、簡化合成步驟，增強人工合成材料結(jié)構(gòu)的可修飾性；另一方面進行材料的功能性復(fù)合，同時，降低人工合成材料的細胞毒性及可能免疫應(yīng)激反應(yīng)，保證其生物親合性能，這對于新型功能材料的研發(fā)工作意義重大。此外，相較于天然來源材料的復(fù)雜性與分離提純難度[3]，人工合成材料來源單純，其結(jié)構(gòu)與相對分子質(zhì)量均處于一定的可調(diào)控范圍，便于設(shè)計精準(zhǔn)實驗方案、系統(tǒng)考察合成材料的穩(wěn)定性與毒性，建立仿生黏合材料在生命體環(huán)境中的安全性和適用性的系統(tǒng)評價參數(shù)。

作為一種生物黏合劑[4]，貽貝黏附蛋白(MAP)結(jié)構(gòu)中的黏合單元鄰二酚[5]，能夠通過在水環(huán)境中的離解與帶電[6]、氧化與交聯(lián)[7]等作用過程，實現(xiàn)貽貝在巖石、鋼鐵、玻璃等多種材料界面的穩(wěn)定黏合[8-9]。設(shè)計在人工合成黏合劑中引入高化學(xué)活性的鄰二酚黏合單元[10]，能夠降低合成材料的細胞毒性及可能免疫應(yīng)激反應(yīng)，改善人工黏合劑的黏附與生物相容性能。另外，借助于聚氨酯材料的化學(xué)修飾活性[11]，通過聚氨酯材料的擴鏈與功能片段接入等過程，能夠有效簡化合成步驟。本文設(shè)計以擴鏈、偶聯(lián)兩步主要反應(yīng)，合成得到一種MAP型聚氨酯黏合材料，并進行路線優(yōu)化、熱穩(wěn)定性與細胞毒性考察，初步評價了該聚氨酯黏合材料應(yīng)用于生命體環(huán)境的安全性和適用性[12]。此外，合成路線的分段調(diào)控加強了黏合材料合成的可修飾性，為人工黏合材料未來研發(fā)工作中的分節(jié)點合成與功能化修飾提供了參考。

1 實驗部分

1.1 原料

二丁基二月桂酸錫(DBTL)：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；聚丙二醇400(PPG 400)、異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)、二羥甲基丙酸(DMPA)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、多巴胺鹽酸鹽、N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺、二甲基亞砜(DMSO)：分析純，阿拉丁試劑有限公司。上述市售試劑均經(jīng)過除水等預(yù)處理，具體方法為：PPG 400、DMPA于100 ℃下減壓干燥3 h；DMF以干燥劑無水硫酸鈉進行初步無水處理，再經(jīng)90 ℃減壓蒸餾，加入4?分子篩(孔徑為0.4 nm)，待用；三乙胺以干燥劑無水硫酸鈉進行初步無水處理，再經(jīng)常壓蒸餾，加入4?分子篩(孔徑為0.4 nm)，待用。

1.2 儀器及設(shè)備

傅里葉變換紅外分光光度計：TENSOR T-27，德國BRUKER公司；超導(dǎo)核磁共振波譜儀：AVANCE Ⅲ 400 MHz，德國BRUKER公司；凝膠滲透色譜儀：PL-GPC50，美國Agilent Technologie公司；熱失重分析儀：PE-TGA7，美國Perkin Elmer公司；多功能酶聯(lián)免疫檢測儀：1510 Mwltiskan Go，美國Thermo Fisher公司。

1.3 合成制備

為了加強合成材料的化學(xué)修飾性，目標(biāo)MAP型聚氨酯黏合材料以擴鏈與偶聯(lián)為主要合成步驟進行分段調(diào)控法合成，引入鄰二酚黏合單元。首先，初步保證該合成材料的低毒性及生物相容性；其次，使人工黏合材料未來研發(fā)工作中的分節(jié)點合成與功能化修飾進一步成為可能。

目標(biāo)聚氨酯黏合材料設(shè)計擴鏈、偶聯(lián)兩步合成路徑(見圖1)：1)以IPDI與PPG 400為初始原料，得到聚氨酯預(yù)聚物(化合物1)，再經(jīng)擴鏈劑DMPA、縮合劑DCC與催化劑DBTL共同作用于擴鏈步驟，得到聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物(化合物2)；2)為了進一步改善目標(biāo)材料的聚合性能及相對分子質(zhì)量分布，在平均相對分子質(zhì)量較小的擴鏈產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過功能修飾調(diào)控與鄰二酚黏合單元接入，合成得到目標(biāo)MAP型聚氨酯黏合材料(化合物3)。

圖1 MAP型聚氨酯黏合材料的合成路徑

(1)化合物1：聚氨酯預(yù)聚物的合成

將IPDI、PPG 400(物質(zhì)的量比為2∶1.2)與適量溶劑DMF混合均勻，氮氣保護反應(yīng)6 h，經(jīng)減壓蒸餾，得到無色至淺黃色油狀物的聚氨酯預(yù)聚物，即PPG400-IPDI(化合物1)。

(2)化合物2：聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物的合成

作為高分子材料擴鏈與枝節(jié)化的關(guān)鍵步驟，擴鏈劑DMPA與催化劑DBTL的反應(yīng)投入量對聚氨酯預(yù)聚物擴鏈合成步驟具有重要意義。為了篩選最優(yōu)條件，調(diào)控化合物1、DMPA與DBTL物質(zhì)的量比分別為1∶1∶0.2、1∶2∶0.2、1∶2∶0，合成得到三種不同投料比的預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物P1、P2、P3。經(jīng)后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)得到三種終產(chǎn)物，即分別以P1、P2、P3衍生修飾的黏合材料。進行三種黏合材料的紅外光譜與核磁共振氫譜測定，結(jié)合光譜結(jié)果，分析以P1、P2、P3衍生修飾的三種黏合材料的枝節(jié)率水平與擴鏈程度，考察DMPA與DBTL兩種關(guān)鍵反應(yīng)物對預(yù)聚物擴鏈反應(yīng)的影響，進而確定最優(yōu)反應(yīng)投料比為化合物1、DMPA與DBTL物質(zhì)的量比為1∶2∶0.2。

根據(jù)上述反應(yīng)物投料比篩選的最優(yōu)條件，將步驟(1)得到的化合物1、DMPA、DBTL(物質(zhì)的量比為1∶2∶0.2)與適量溶劑DMF混合均勻，氮氣保護反應(yīng)3 h，得到無色至淺黃色油狀物的聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物，即化合物2。

(3)化合物3：MAP型聚氨酯黏合材料的合成

將步驟(2)得到的化合物2、DCC、多巴胺鹽酸鹽、三乙胺(物質(zhì)的量比為1∶0.12∶1∶0.1)與適量溶劑DMF混合均勻，氮氣保護反應(yīng)8 h，得到粗產(chǎn)物沉淀，進行粗產(chǎn)物沉淀酸洗、透析，得到淺黃色油狀物的MAP型聚氨酯黏合材料，即化合物3。

2 結(jié)果與討論

2.1 MAP型聚氨酯黏合材料的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 紅外光譜對材料枝節(jié)率水平的反映

將以P1、P2衍生修飾的兩種黏合材料分別進行KBr壓片與紅外光譜測定，得到其紅外吸收光譜，如圖2所示。其中，3 475 cm-1處酚羥基與1 645 cm-1處酰胺鍵的特征吸收峰說明聚氨酯材料側(cè)鏈已成功接入了鄰二酚黏合單元。

波數(shù)/cm-1

同時，紅外光譜出峰強度也具有定量意義，能在一定程度上反映黏合材料聚氨酯側(cè)鏈中黏合單元多巴胺的引入量以及材料枝節(jié)率水平。P1與P2分別由化合物1、DMPA、DBTL物質(zhì)的量比1∶1∶0.2與1∶2∶0.2得到，再經(jīng)偶聯(lián)修飾后，得到以P1、P2衍生修飾的兩種黏合材料，對比兩種黏合材料紅外光譜特征峰的出峰強度，可知擴鏈劑DMPA的用量加倍時，材料枝節(jié)率水平得到明顯提高。

2.1.2 核磁共振氫譜對催化劑影響擴鏈反應(yīng)的判斷

合成聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物(化合物2)的擴鏈步驟中，為了確定催化劑DBTL對目標(biāo)聚氨酯黏合材料擴鏈程度的影響，設(shè)計催化劑加入與未加入兩條合成路徑，分別得到P2與P3兩種聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物，經(jīng)由后續(xù)偶聯(lián)反應(yīng)，得到以P2、P3衍生修飾的兩種黏合材料，將其分別標(biāo)注為(PPG 400-IPDI)-DMPA+DBTL(P2)、PPG 400-IPDI)-DMPA(P3)。測定上述兩種黏合材料1H NMR(DMSO-d6，TMS)，得到如圖3所示的核磁共振氫譜，特征氫的化學(xué)位移(δ)見圖3中的歸屬及標(biāo)注。

圖3中，δ=7.82與3.60分別對應(yīng)于羧基與酚羥基中活潑氫的特征位移，說明聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物與多巴胺鹽酸鹽的反應(yīng)已在聚氨酯材料側(cè)鏈成功接入鄰二酚黏合單元。此外，對比圖3(a)與(b)兩個系列的譜線，即以P2及P3衍生修飾的兩種黏合材料，在保持兩組譜線1H NMR測樣量一致時，擴鏈反應(yīng)中加入催化劑DBTL、再經(jīng)后續(xù)偶聯(lián)反應(yīng)，得到的(PPG 400-IPDI)-DMPA+DBTL(P2)，其特征氫的譜線強度均有顯著增強。經(jīng)1H NMR測試，證明催化劑DBTL能顯著提高目標(biāo)MAP型聚氨酯黏合材料的枝節(jié)率，從而進一步影響材料性能。

δ(a) (PPG 400-IPDI)-DMPA+DBTL(P2)

綜合紅外與核磁譜圖分析結(jié)果可以看出，相較于P1、P3，以最優(yōu)反應(yīng)投料比得到的聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物P2為基礎(chǔ)合成的MAP型聚氨酯黏合材料，表現(xiàn)較高枝節(jié)率與擴鏈程度，因此對該黏合材料進行進一步的相對分子質(zhì)量分布測定、熱穩(wěn)定性與安全性分析。

2.1.3 凝膠滲透色譜對材料相對分子質(zhì)量分布的反映

以DMF為流動相，聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)聚合物(溫度為40 ℃，流速為1.0 mL/min)，合成得到的MAP型聚氨酯黏合材料經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，得到聚合材料的相對分子質(zhì)量分布，如圖4和表1所示。

相對分子質(zhì)量

表1 MAP型聚氨酯黏合材料的相對分子質(zhì)量及其分布1)

1)Mw/Mn為多分散指數(shù)；Mp為峰位相對分子質(zhì)量；Mn為數(shù)均相對分子質(zhì)量；Mw為重均相對分子質(zhì)量；Mz為z均相對分子質(zhì)量；Mz+1為z+1均相對分子質(zhì)量；Mv為黏均相對分子質(zhì)量。

由表1中的Mw/Mn=1.021 32可知，多分散指數(shù)接近于1，表明所合成的高分子聚氨酯黏合材料聚合分布均勻，其Mv為955。

2.2 MAP型聚氨酯黏合材料的熱穩(wěn)定性與安全性評價

2.2.1 熱穩(wěn)定性

40～800 ℃溫度范圍內(nèi)，進行所合成MAP型聚氨酯黏合材料的熱失重分析(氮氣環(huán)境，升溫速率為20 ℃/min，樣品用量為5 mg)，得到其熱重分析曲線，如圖5所示。

t/℃

由圖5可知，合成的聚氨酯黏合材料表現(xiàn)良好的熱穩(wěn)定性，熱失重趨勢平滑、曲線連續(xù)，與彈性體的熱穩(wěn)定性具有相似之處[13-14]。聚氨酯合成材料具有兩個熱失重階段，分別為150～250 ℃軟段熱失重與250～320 ℃硬段熱失重，其中，軟段失重因IPDI和DMPA分解而產(chǎn)生，硬段失重因PPG 400分解而產(chǎn)生。

2.2.2 細胞毒性

以四氮唑藍比色法(MTT)評價所合成MAP型聚氨酯黏合材料的細胞毒性，得到聚氨酯合成材料對體外活細胞的增殖抑制作用曲線，如圖6所示。在溫度為37 ℃、CO2含量為5%(體積分?jǐn)?shù))、濕度為90%的條件下，將所合成聚氨酯黏合材料的DMF溶液加入培養(yǎng)24 h的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(EVC304)中，進行目標(biāo)材料的質(zhì)量濃度梯度分組，使各組聚氨酯黏合材料的最終質(zhì)量濃度分別為125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/L，每組質(zhì)量濃度設(shè)6個平行孔，對照組加入等體積溶劑。加樣后，于上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL四氮唑藍溶液和180 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h。移去上清液，每孔再加入DMSO150 μL，充分震蕩后測定490 nm處吸光度[15-16]，計算MAP型聚氨酯黏合材料對EVC304細胞的24 h增殖抑制率：細胞增殖抑制率=(1-吸光度實驗組/吸光度對照組)×100%，得到細胞增殖抑制曲線，如圖6所示。

黏合材料質(zhì)量濃度/(μg·L-1)

由圖6可以看出，MAP型聚氨酯黏合材料對EVC304細胞表現(xiàn)低毒性。聚氨酯合成材料在ECV304細胞中的增殖抑制作用隨自身濃度增加而增大，就其濃度增幅的整體趨勢而言，聚氨酯合成材料呈現(xiàn)低毒性[17]。

3 結(jié) 論

(1)基于MAP結(jié)構(gòu)中鄰二酚功能片段的黏合機制，進行聚氨酯材料的功能化修飾，合成得到MAP型聚氨酯黏合材料。

(2)合成得到的MAP型聚氨酯黏合材料聚合分布均勻，多分散指數(shù)接近于1，Mv為955，熱失重曲線連續(xù)，熱穩(wěn)定性良好，溫度高于150 ℃時出現(xiàn)熱失重。

(3)所合成的MAP型聚氨酯黏合材料對體外活細胞表現(xiàn)低毒性，黏合材料質(zhì)量濃度為4 000 μg/L時，其對ECV304細胞的24 h增殖抑制作用低于30%，具有進一步應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的良好前景。