楊洪生，任娣，譚秀慧，朱曉華，楊總，沈美芳*

(1.江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，南京 210017；2.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 200335)

頭孢菌素是與青霉素同屬的β-內(nèi)酰胺類抗生素，是7-氨基頭孢烷酸的衍生物，具有廣譜殺菌強、耐青霉素酶、過敏反應少等特點，被廣泛用于人和動物的疾病治療[1-2]。在動物養(yǎng)殖過程中，濫用、誤用、違規(guī)使用頭孢菌素會導致動物源性食品中頭孢菌素的蓄積，使消費者產(chǎn)生過敏反應、細菌耐藥性等方面的危害[3-4]，因此美國、日本及歐盟等針對奶類、肉類及內(nèi)臟中部分頭孢菌素制定了最大殘留限量[5]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚病治療和預防的需要，目前市場上出現(xiàn)了許多含頭孢菌素的水產(chǎn)養(yǎng)殖用品[2]，但GB 31650－2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中只規(guī)定了牛、豬中頭孢氨芐、頭孢喹肟和頭孢噻呋的最大殘留限量，沒有對水產(chǎn)品中頭孢菌素殘留限量進行明確的規(guī)定。

動物源性食品中頭孢菌素殘留量的檢測方法主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-7]。由于動物源性食品的組分復雜，采用微生物法和酶聯(lián)免疫法測定時易受干擾，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；薄層色譜法和液相色譜法只能分析一種或幾種頭孢菌素，且靈敏度低、檢出限高，缺乏有效的定性手段；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，能夠滿足動物源性食品中多種頭孢菌素的定性與定量分析[8]。但是，樣品基質(zhì)會抑制或增強目標物的響應，同位素稀釋法能夠補償樣品基質(zhì)效應的影響，并且避免因樣品前處理操作引入誤差，提高方法的準確度和重現(xiàn)性，是補償基質(zhì)效應較理想的方法[9-10]。現(xiàn)有的方法均采用外標法對頭孢菌素進行檢測，如GB/T 22960－2008《河豚魚和鰻魚中頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》僅適用于河豚魚和鰻魚中5種頭孢菌素測定，且該方法在實際使用中存在部分操作難以完成、液液萃取除雜效果不佳、基質(zhì)干擾較強和回收率偏低等缺點[2]，因此有必要建立一種以內(nèi)標法為基礎(chǔ)的水產(chǎn)品中頭孢菌素殘留量的檢測方法。鑒于此，本工作通過優(yōu)化樣品前處理方法、液相色譜和質(zhì)譜條件，采用內(nèi)標法定量，提出了同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中15種頭孢菌素殘留量的方法，以滿足水產(chǎn)品中頭孢菌素殘留量測定的需要。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Triple Quad 5500 型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀；Allegra 64R 型高速冷凍離心機；Turbo Vap＠LV 型全自動氮吹濃縮儀；DMT-2500型渦旋混合器；Milli-Q 型純水儀；Visiprep 型固相萃取裝置。

單標準儲備溶液：分別稱取15種頭孢菌素標準品各5 mg，用50%(體積分數(shù)，下同)乙腈溶液溶解并定容至50 mL，配制成15種頭孢菌素質(zhì)量濃度均為100 mg·L－1的單標準儲備溶液，于4 ℃避光保存。同法配制7種內(nèi)標質(zhì)量濃度均為50 mg·L－1的單標準儲備溶液，于4 ℃避光保存。

混合標準溶液：1 mg·L－1，移取適量的15種頭孢菌素單標準儲備溶液，用50%乙腈溶液定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·L－1的頭孢菌素混合標準溶液，于4 ℃避光保存。同法配制成質(zhì)量濃度為100μg·L－1的內(nèi)標混合溶液，于4 ℃避光保存。使用時，用50%乙腈溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

頭孢克洛、頭孢吡啉、頭孢羥氨芐、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢拉定、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢孟多、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢他美、頭孢匹羅、頭孢吡啉-d4、頭孢羥氨芐-d4、頭孢氨芐-d5、頭孢洛寧-d4、頭孢噻肟-d3、頭孢唑啉-13C215N、頭孢噻呋-d3標準品的純度均大于96.0%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；酸性氧化鋁(規(guī)格0.075～0.150 mm)為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent Infinity Lab Poroshell 120 SB C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7μm)；柱溫35 ℃；流量0.4 mL·min－1；進樣量2.0μL；流動相A 為0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3.0 min時，B 為5%；3.0～6.0 min時，B 由5%升至60%；6.0～6.1 min 時，B 由60%跳轉(zhuǎn)至5%，保持3.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描(ESI＋)；多反應監(jiān)測(MRM)模式；噴霧電壓5 500 V；離子源溫度350 ℃；氣簾氣壓力240 k Pa，霧化氣壓力380 k Pa，輔助加熱氣壓力380 kPa；入射電壓10 V，碰撞室電壓9 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1，其中，“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1(續(xù))

1.3 試驗方法

將購自某農(nóng)貿(mào)市場的草魚、南美白對蝦和中華絨螯蟹按照GB/T 30891－2014《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》附錄B的步驟進行制樣，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取處理好的樣品5 g(精確至0.01 g)置于50 mL聚乙烯離心管中，加入100μg·L－1內(nèi)標混合溶液200μL，靜置30 min后，再加入酸性氧化鋁2 g和80%(體積分數(shù)，下同)乙腈溶液5 mL，以轉(zhuǎn)速2 500 r·min－1渦旋10 min，超聲5 min，于4 ℃以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL濃縮管中；再用5 mL 80%乙腈溶液重復提取一次，合并兩次上清液。將上清液轉(zhuǎn)移至Oasis Prime HLB固相萃取小柱(150 mg/3 mL)中，收集流出液，于40 ℃氮吹至1 mL 左右，再加入1 mL含0.1%(體積分數(shù))甲酸的乙腈溶液，用0.22μm 尼龍濾膜過濾，按照儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

頭孢菌素的母體結(jié)構(gòu)為7-氨基頭孢烷酸，既含有羧基，又有酰胺基，為兩性化合物[1-2]，常用C18色譜柱對其進行分離。本工作以Agilent Infinity Lab Poroshell 120 SB C18色譜柱為固定相時，各目標物的分離效果好，色譜峰峰形尖銳。

通常在流動相中加入適量的甲酸或乙酸銨等物質(zhì)，可以提高目標物的離子化效率，改善分離效果[11-13]，因此試驗考察了不同流動相體系(0.1%甲酸溶液-乙腈、5 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈)對15種頭孢菌素分離效果的影響。結(jié)果顯示：當以5 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈體系為流動相時，大部分頭孢菌素的色譜峰峰形變寬，響應強度較低；當以0.1%甲酸溶液-乙腈體系為流動相時，15種頭孢菌素的色譜峰峰形較好，響應強度較高。因此，試驗選擇的流動相體系為0.1%甲酸溶液-乙腈。

采用流動注射的方式，在ESI＋下分別對50μg·L－1頭孢菌素混合標準溶液和50μg·L－1內(nèi)標混合溶液進行分析，得到各目標物的分子離子[M＋H]＋；以分子離子為母離子，對其進行二級質(zhì)譜掃描；每個頭孢菌素選擇干擾小、信噪比大的兩個子離子分別作為定量和定性離子，內(nèi)標只選取一個離子，用于對應頭孢菌素的定量，并進一步優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。按照優(yōu)化后的色譜、質(zhì)譜條件，對10μg·L－1頭孢菌素混合標準溶液及20μg·L－1內(nèi)標混合溶液進行試驗，15種頭孢菌素和7種內(nèi)標的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 MRM 色譜圖Fig.1 MRM Chromatograms

2.2 提取劑的優(yōu)化

頭孢菌素的提取劑一般采用乙腈、甲酸-乙腈的混合液、乙腈溶液等[2，14]。試驗以草魚為研究對象，采用外標法，考察了以乙腈、含0.2%(體積分數(shù)，下同)甲酸的乙腈溶液、80%乙腈溶液為提取劑時對15種頭孢菌素回收率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知：以乙腈、含0.2%甲酸的乙腈溶液為提取劑時，15種頭孢菌素的回收率差異性不大，雖然頭孢吡啉、頭孢喹肟、頭孢他美和頭孢匹羅等部分頭孢菌素的回收率超過70.0%，但頭孢克洛、頭孢羥氨芐和頭孢拉定等頭孢菌素的回收率明顯偏低；以80%乙腈溶液為提取劑時，各目標物的回收率較高，除頭孢羥氨芐的回收率在40.0%左右，其余頭孢菌素的回收率均在60.0%以上。因此，試驗選擇以80%乙腈溶液為提取劑。

圖2 提取劑對15種頭孢菌素回收率的影響Fig.2 Effect of extract agent on recovery of 15 cephalosporins

2.3 固相萃取小柱的優(yōu)化

試驗考察了Oasis Prime HLB、Oasis HLB 固相萃取小柱對提取液凈化效果的影響。結(jié)果顯示，Oasis Prime HLB、Oasis HLB 固相萃取小柱對頭孢菌素的凈化效果影響不大，但使用Oasis Prime HLB固相萃取小柱時不需要活化、淋洗和洗脫等常規(guī)步驟，大大縮短了凈化時間，同時還能夠有效地去除提取液中蛋白質(zhì)、鹽和磷脂等雜質(zhì)，減小基質(zhì)效應[15-16]，因此試驗選擇Oasis Prime HLB固相萃取小柱來凈化提取液。

2.4 標準曲線、檢出限與測定下限

移取適量的頭孢菌素混合標準溶液和內(nèi)標混合溶液，配制成15種頭孢菌素質(zhì)量濃度分別為2.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0μg·L－1，7種內(nèi)標的質(zhì)量濃度均為20.0μg·L－1的混合標準溶液系列，按照儀器工作條件對上述混合標準溶液系列進行測定。以頭孢菌素的質(zhì)量濃度為橫坐標，其對應的響應值與內(nèi)標響應值的比值為縱坐標繪制標準曲線，線性參數(shù)見表2。

按照試驗方法對草魚空白加標樣品(頭孢唑啉、頭孢哌酮的加標量為5.0μg·kg－1，其余頭孢菌素的加標量為2.0μg·kg－1)進行測定，以3 倍和10倍信噪比(S/N)分別計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精確度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗，每個濃度水平平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n=6)

表3(續(xù))

結(jié)果顯示：15種頭孢菌素在草魚中的回收率為82.9%～119%，RSD 為1.6%～6.5%；在南美白對蝦中的回收率為75.9%～118%，RSD 為1.6%～6.3%；在中華絨螯蟹中的回收率為82.2%～118%，RSD 為1.8%～6.4%。說明該方法的準確度與精密度能滿足水產(chǎn)品中頭孢菌素殘留的分析要求。

2.6 樣品分析

按照試驗方法對10份草魚、10份南美白對蝦和10份中華絨螯蟹樣品進行分析。結(jié)果顯示，1份草魚樣品中檢出頭孢氨芐，檢出量為3.78μg·kg－1，其余樣品均未檢出頭孢菌素。

本工作通過優(yōu)化提取劑和固相萃取小柱，采用同位素稀釋，內(nèi)標法定量，提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中15種頭孢菌素殘留量的方法。該方法前處理過程簡便、準確度高、靈敏度好，能夠用于水產(chǎn)品中頭孢菌素殘留量的檢測。