朱燕燕，馬桂娟，湯麗華，王鵬，馬雪梅

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院，銀川 750001)

喹諾酮類化合物又被稱為吡啶酮酸類或者吡酮酸類化合物，是一類人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗生素，其中諾氟沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星等因具有抗菌譜廣、高效低毒、價格低廉、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，在畜禽動物的疾病防治及臨床治療感染方面具有廣泛的應(yīng)用[1-2]。然而，由于喹諾酮類藥物具有致癌及致突變等特點，若長期食用被該類藥物污染的食品，會影響人體正常的腸道菌群分布，并使人的致病菌產(chǎn)生耐藥性[3-4]，從而對人體健康造成嚴重威脅。濫用該類藥物引發(fā)的環(huán)境問題及人類疾病風(fēng)險已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點，美國、歐盟及中國均對喹諾酮類藥物規(guī)定了相應(yīng)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。目前，針對該類藥物測定方法的研究，主要涉及動物源性食品[5-6]，而對于植物源性豆制品中該類藥物的測定研究鮮有報道。豆制品在生產(chǎn)過程中容易滋生大腸桿菌、假單胞菌等微生物[7]，較易腐爛變質(zhì)，一些不法商販為增強產(chǎn)品抗菌能力，在其生產(chǎn)過程中違規(guī)濫用喹諾酮類藥物的情況時有發(fā)生。因此，為滿足日常監(jiān)管的需要，建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏度高的測定方法具有重要的意義。

目前，關(guān)于食品中喹諾酮類藥物測定的相關(guān)報道有很多，測定方法主要涉及高效液相色譜法[8-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]、毛細管電泳法[14]、熒光光譜法[15]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[16-17]等。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合了高效液相色譜技術(shù)的高分離能力和質(zhì)譜分析技術(shù)的可提供目標(biāo)物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的特點，具有靈敏度高、選擇性好和準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢，是目前復(fù)雜基質(zhì)中痕量及超痕量抗生素分析的首選方法。本工作通過對提取劑、流動相和色譜柱等關(guān)鍵因素的優(yōu)化，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定豆制品中氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星和司帕沙星等11種喹諾酮類藥物的含量，并進行方法學(xué)的驗證。該方法簡便、快速、靈敏度高、選擇性好，各項技術(shù)指標(biāo)均能滿足豆制品中11種喹諾酮類藥物的測定需求，可為豆制品中喹諾酮類藥物殘留的質(zhì)量安全監(jiān)測和風(fēng)險評估提供技術(shù)支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460 LC-MS/MS高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配AJS ESI 離子源及Mass Hunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；3-15 型高速離心機；Vortex Genie 2 型渦旋混勻儀；MV5 型氮吹儀；BT25S型分析天平；Milli-Q 型超純水儀；Waters Oasis PRi ME HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別稱取11種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品和3種氘代喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(內(nèi)標(biāo))適量，用乙腈溶解并定容至10 mL 的容量瓶中，配制成1.0 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于－18 ℃避光儲存，保存期限為6個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：1.0 mg·L－1，分別移取11種喹諾酮類藥物單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，混合后用甲醇逐級稀釋得到1.0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)溶液：1.0 mg·L－1，分別移取3種氘代喹諾酮類藥物單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，混合后用甲醇逐級稀釋得到1.0 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃避光保存。

乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)-Mcllvaine緩沖溶液：將1 000 mL 0.1 mol·L－1檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol·L－1的磷酸氫二鈉溶液混合，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，得到Mcllvaine緩沖溶液。再稱取60.5 g Na2EDTA 至1 625 mL Mcllvaine 緩沖溶液中，超聲使其溶解，得到Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。

11種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品和3種氘代喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品的純度和CAS號見表1。

表1 各標(biāo)準(zhǔn)品的純度和CAS號Tab.1 Purity and CAS number of each standard substance

檸檬酸、磷酸氫二鈉、Na2EDTA、氨水均為優(yōu)級純；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純；試驗用水為超純水；豆腐、豆皮、豆干為日常監(jiān)督抽檢樣品和市售樣品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流量0.3mL·min－1；進樣體積10μL；柱溫25℃；運行時間15 min；流動相A 為含0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min時，A 為90%；1.0～4.0 min時，A 由90%降至85%；4.0～8.0 min 時，A 由85%降 至80%；8.0～10.0 min時，A 由80%降至70%，保持1.0 min；11.0～11.5 min時，A 由70%降至5%，保持1.5 min；13.0～13.1 min 時，A由5%跳轉(zhuǎn)至90%，保持1.9min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源，正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流量11.0 L·min－1；霧化器壓力310.26 k Pa；噴嘴電壓500 V；毛細管電壓3.5 kV；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“*”為定量離子。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取

將豆制品搗碎攪拌均勻后，于－18 ℃儲存。準(zhǔn)確稱取5.00 g均勻制備的樣品于50 mL 具塞離心管中，移取1.0 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液20 mL，渦旋提取1 min，超聲15 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r·min－1離心5 min，收集上清液于50 mL 容量瓶中，殘渣用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液重復(fù)提取2次，每次10 mL，合并提取液于50 mL 容量瓶中，用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液定容，混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，以轉(zhuǎn)速8 000 r·min－1離心5 min，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

Waters Oasis PRi ME HLB固相萃取柱使用前依次用甲醇6 mL、水6 mL 活化平衡，移取上述提取液25 mL過固相萃取柱，控制流量每秒1～2滴，待樣液全部通過固相萃取柱后，用5%(體積分數(shù))甲醇溶液3 mL淋洗，減壓抽干，依次用甲醇6 mL和含25%(體積分數(shù))氨水的甲醇溶液3 mL 洗脫，接收全部洗脫液，于45 ℃氮吹至近干，加入初始流動相2.0 mL復(fù)溶，經(jīng)0.22μm 水相濾膜過濾后上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱

試驗分別考察了以Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm，1.8μm)和ACQUITY UPLC＠ BEH HILIC(100 mm ×2.1 mm，1.7μm)為色譜分析柱時待測物的分離度和峰形。結(jié)果表明，Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5μm)具有更高的柱效，穩(wěn)定性強，分離度高，并且填充物粒徑較大，抗污染能力較強，適于基質(zhì)較為復(fù)雜的豆制品的分析。通過該色譜柱對目標(biāo)物進行分離，11種目標(biāo)物的保留時間在4.91～8.13 min內(nèi)。

2.1.2 流動相

試驗比較了分別以乙腈-水和甲醇-水等體系作為流動相時對11種目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-水體系作為流動相時，目標(biāo)物具有更高的分離度和靈敏度。在正離子模式下，水相中加入甲酸會促進目標(biāo)物的離子化，使靈敏度增加，而乙酸銨可以改善目標(biāo)物的峰形，因此試驗對比了含0.1%甲酸的1 mmol·L－1乙酸銨溶液、含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液、含0.2%(體積分數(shù))甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動相水相時，對目標(biāo)物靈敏度和峰形的影響。

結(jié)果表明：在5 mmol·L－1乙酸銨溶液中分別添加體積分數(shù)為0.1%，0.2%的甲酸作為流動相水相時，11 種喹諾酮類藥物的離子化效率變化不明顯，因此選擇添加0.1%甲酸；而5 mmol·L－1乙酸銨溶液相較于1，2 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動相水相時，目標(biāo)化合物峰形更優(yōu)。因此，最終確定以含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液和乙腈的混合液作為流動相，并對流動相的梯度洗脫條件進行優(yōu)化，以使目標(biāo)化合物達到基線分離，優(yōu)化得到的梯度洗脫條件見表1。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣的方式，分別將11種喹諾酮類藥物和3種氘代喹諾酮類藥物的1.0 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過毛細管注入ESI。在正離子掃描模式下，對所有化合物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，找到特征碎片離子、最優(yōu)碎裂電壓和最優(yōu)碰撞能量，每種化合物均選擇兩對信噪比高、干擾小、響應(yīng)高的離子作為定量離子和定性離子，以滿足歐盟委員會指令96/23/EC 對定性分析的要求，并依據(jù)化合物保留時間和相對離子豐度進行定性分析。優(yōu)化的質(zhì)譜條件見1.2.2節(jié)。

在MRM 模式下，采用優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件對目標(biāo)化合物進行有效分離，采集得到的目標(biāo)物的總離子流色譜圖見圖1，提取離子色譜圖見圖2。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram

圖2 提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms

2.3 樣品提取條件的優(yōu)化

喹諾酮類藥物具有羧基和哌嗪環(huán)，屬于兩性物質(zhì)，在酸性和堿性溶劑中均具有良好的溶解性，因此酸性溶劑、堿性溶劑及純有機溶劑均可用于目標(biāo)化合物的提取。試驗比較了分別以乙腈、含2%(體積分數(shù)，下同)甲酸的乙腈溶液、甲醇、含2%甲酸的甲醇溶液和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液為提取劑時對11 種喹諾酮類藥物回收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取劑對11種喹諾酮類藥物回收率的影響Fig.3 Effect of extracting solution on recovery of the eleven quinolones

結(jié)果表明，采用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取劑時，11 種喹諾酮類藥物的回收率為85.5%～115%，較其他4種提取劑更優(yōu)。原因可能是在使用乙腈和甲醇作為提取劑時，樣品中的蛋白質(zhì)等極易快速沉淀，使目標(biāo)化合物被包裹而損失，導(dǎo)致目標(biāo)化合物回收率下降。

另外，試驗比較了不同超聲時間(5，10，15，20 min)對目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明：超聲時間為5，10 min時，目標(biāo)化合物提取不完全，回收率較低；而超聲時間為15，20 min時，回收率較高但差別不大。

因此，試驗選擇對試驗人員身體危害較小的無機試劑Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液超聲15 min的方式，提取豆制品中11種喹諾酮類藥物。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

豆制品基質(zhì)較為復(fù)雜，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)，提取后需要徹底凈化才能進行質(zhì)譜分析，否則會產(chǎn)生嚴重的基質(zhì)效應(yīng)，污染色譜柱和質(zhì)譜檢測器。試驗比較了 Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱和Cleanert Alumina固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明：采用Waters Oasis PRi ME HLB固相萃取柱凈化時，11種喹諾酮類藥物的回收率為70.8%～112%，而以Cleanert Alumina固相萃取柱凈化時的回收率僅為46.3%～82.1%；而且Waters Oasis PRi ME HLB固相萃取柱具有更好的凈化效果。如果樣品前處理所采用的原理和液相色譜分析的原理是正交不相關(guān)的，即二者是完全不同的的保留機理，則通常可以得到更好的凈化效果。鑒于試驗使用反相色譜柱進行分離，凈化過程選擇HLB 固相萃取柱，具有更好的凈化分離效果。因此，試驗選擇Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行凈化。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測時，由于流動相、目標(biāo)化合物和樣液中的共提取物同時進入質(zhì)譜系統(tǒng)，會對目標(biāo)離子的離子化過程造成影響，使得目標(biāo)化合物的響應(yīng)減弱或者增強，進而影響定量分析的準(zhǔn)確度[18]。試驗繪制空白基質(zhì)配制的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的工作曲線和甲醇配制的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的曲線，依據(jù)計算公式(1)來判斷基質(zhì)效應(yīng)(ME)的強弱：當(dāng)ME 值等于1時，不存在基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME值小于1時，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME值大于1時，存在基質(zhì)增強效應(yīng)；當(dāng)ME值在0.8～1.2內(nèi)時，基質(zhì)效應(yīng)很弱，可以忽略。

式中：Km為空白基質(zhì)配制的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的工作曲線的斜率；Ks為甲醇配制的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液系列曲線的斜率。

所得11種喹諾酮類藥物的ME值見表3。

表3 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Tab.3 Results of test for matrix effect

由表3 可知，11 種喹諾酮類藥物的ME 值為0.68～1.04，說明試驗宜采用基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行定量分析。

2.6 工作曲線、檢出限和測定下限

試驗以不含目標(biāo)化合物的新鮮豆腐作為空白樣品，按照1.3節(jié)對樣品進行前處理得到空白豆腐基質(zhì)溶液。分別移取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，準(zhǔn)確加入適量的內(nèi)標(biāo)溶液，用空白豆腐基質(zhì)溶液稀釋，配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，300.0，400.0μg·L－1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為25.0μg·L－1，按儀器工作條件進行測定。以11種目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，11種目標(biāo)化合物的定量離子峰面積與其內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：11種喹諾酮類藥物的工作曲線的線性范圍為0.5～400.0μg·L－1，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，其線性回歸方程見表4。

采用空白基質(zhì)添加各單標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，并與國家市場監(jiān)督管理總局2019年第15號BJS 201909《豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定》中的檢出限進行比較，結(jié)果見表4。

表4 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.4 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收試驗

結(jié)合藥物的殘留限量要求，分別在空白新鮮豆腐和豆皮樣品中添加15.0，40.0，80.0μg·kg－1等3個濃度水平的11種喹諾酮類藥物，按照試驗方法進行測定，每個濃度水平重復(fù)測定6次，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表5。

表5 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n=6)

表5(續(xù))

由表5 可知，11 種目標(biāo)化合物的回收率為72.2%～119%，RSD 為2.6%～9.7%，說明各化合物的準(zhǔn)確度和精密度均符合方法學(xué)要求。

2.8 樣品分析

用本方法對日常監(jiān)督抽檢及市售的共58批豆腐、豆皮和豆干制品進行測定，結(jié)果顯示，11種喹諾酮類藥物殘留均未檢出。

本工作提出了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定豆制品中11種喹諾酮類藥物殘留量的檢測方法，并對方法的前處理過程和儀器工作條件進行了優(yōu)化，同時利用同位素內(nèi)標(biāo)法和基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液消除基質(zhì)效應(yīng)。該方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，節(jié)省了人員成本和經(jīng)濟成本，能夠滿足豆制品中11種喹諾酮類藥物殘留的檢測需求。