郭文建，張慧，王桂勛，朱晨，李琳，李紅莉，孫俊玲

(山東省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，濟(jì)南 250101)

抗生素具有抗菌和抑菌作用，是藥物和個(gè)人護(hù)理用品的重要組成部分，有效地保障了人們的生命健康[1]。但是，一些抗生素還被大量用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，出現(xiàn)了嚴(yán)重的濫用現(xiàn)象[2-3]?？股乇粍?dòng)物和人體吸收后，只有極少部分通過(guò)新陳代謝生成無(wú)活性產(chǎn)物，大部分會(huì)以原藥的形式隨糞尿排出，進(jìn)入環(huán)境中[4-5]。大多數(shù)抗生素極性強(qiáng)、易溶于水、不易揮發(fā)，在環(huán)境中主要通過(guò)水相傳遞和食物鏈擴(kuò)散。水環(huán)境中的抗生素主要來(lái)源于人類及獸用藥、農(nóng)牧漁養(yǎng)殖廢水、生產(chǎn)廢水或醫(yī)院廢水等[6]，這些廢水會(huì)進(jìn)入污水處理廠，經(jīng)過(guò)處理，僅少數(shù)抗生素可被去除，而大量抗生素最終會(huì)直接流入自然水體中，進(jìn)而危害人類身體健康[7]。因此，測(cè)定廢水中抗生素的含量尤為重要。

近年來(lái)，測(cè)定抗生素的方法主要有高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[10-14]，但是高效液相色譜法無(wú)法克服基質(zhì)干擾，在多組分同時(shí)測(cè)定時(shí)存在一定困難；LC-MS/MS具有更高的靈敏度和選擇性，能夠有效地克服基質(zhì)干擾，適合多組分的同時(shí)測(cè)定。另外，文獻(xiàn)報(bào)道的方法大多只測(cè)定了一種或同類的幾種抗生素，并且研究對(duì)象多集中于河流、湖泊等自然水體，對(duì)醫(yī)院廢水、工業(yè)廢水的研究較少。由于廢水成分復(fù)雜，余氯、過(guò)氧化氫等氧化性物質(zhì)會(huì)對(duì)部分種類抗生素的測(cè)定產(chǎn)生干擾，測(cè)定難度大，因此本工作提出了固相萃取-LC-MS/MS測(cè)定廢水中磺胺類[磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺甲口惡唑(SMZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)]、喹諾酮類[諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFX)、氟羅沙星(FLE)]、大環(huán)內(nèi)酯類[脫水紅霉素(ERY-H2O)、羅紅霉素(ROX)、螺旋霉素(SPM)]等3大類12種抗生素含量的方法，為開(kāi)展廢水中抗生素殘留分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了一定的參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460 型三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Auto Trace 280 型全自動(dòng)固相萃取儀；TurbovapⅡ型有機(jī)樣品濃縮儀；Millipore型超純水機(jī)；Waters Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

抗生素單標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 mg·L－1，稱取12種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L－1的抗生素單標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－10 ℃以下避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：移取適量的12種抗生素單標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋并定容至100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。使用時(shí)，用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液：2.00 mg·L－1，稱取阿特拉津-13C3標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g，用甲醇稀釋并定容至100 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為200 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于－10 ℃以下避光保存。使用時(shí)，用甲醇稀釋至2.00 mg·L－1。

流動(dòng)相A：取0.5 mL甲酸置于500 mL容量瓶中，用體積比為1∶1 的甲醇-乙腈混合液定容，混勻，備用。

流動(dòng)相B：取0.5 mL甲酸置于500 mL 容量瓶中，用水定容，混勻，備用。

稀釋溶劑(初始比例流動(dòng)相)：取25 mL流動(dòng)相A 和75 mL流動(dòng)相B 于100 mL 容量瓶中，混勻，備用。

SMM 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98.0%、SD 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.0%、SDM 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.0%、SMZ標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.5%、SM2 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.6%、NOR 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.1%、CIP標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.2%、OFX 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.0%、FLE標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98.0%、ERY-H2O 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為97.0%、ROX 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為97.0%、SPM標(biāo)準(zhǔn)品的純度為97.0%、阿特拉津-13C3標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.0%。

乙腈、甲醇均為色譜純；甲酸為質(zhì)譜純；乙二胺四乙酸二鈉、抗壞血酸、鹽酸、硫代硫酸鈉均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ZARBAX Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×4.6 mm，1.8μm)；柱溫40℃；進(jìn)樣體積20μL；流量0.3 mL·min－1；流動(dòng)相A 為體積比為1∶500∶500的甲酸-甲醇-乙腈混合液，B 為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～2 min 時(shí)，A 為25%；2～18 min 時(shí)，A 由25%升至60%，保持2 min；20～21 min 時(shí)，A 由60%降至25%，保持4 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源，正離子模式；毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量10 L·min－1；霧化器壓力241.3 k Pa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

取水樣500 mL，用6 mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)水樣酸度至pH2.0～4.0后，再加入150 mg抗壞血酸和250 mg乙二胺四乙酸二鈉。將上述溶液注入經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水、5 mL pH2.0的鹽酸溶液活化的固相萃取柱中，以10～15 mL·min－1流量全部通過(guò)萃取柱后，用5 mL 水進(jìn)行淋洗，棄去流出液，再用氮?dú)獯祾?0 min，然后分兩次加入10 mL甲醇，以5 mL·min－1流量進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液經(jīng)氮吹儀濃縮至近干，加入內(nèi)標(biāo)溶液25μL，用稀釋溶劑定容至1.0 mL，經(jīng)0.22μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，濾液供LC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

移取適量的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，用稀釋溶劑稀釋，配制成12種抗生素質(zhì)量濃度均為100μg·L－1、內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照儀器工作條件，對(duì)上述溶液進(jìn)行測(cè)定，所得總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram

2.2 固相萃取柱的選擇

試驗(yàn)考察了C18(500 mg/6 mL)和 HLB(500 mg/6 mL)兩種固相萃取柱對(duì)空白加標(biāo)水樣(加標(biāo)量100 ng·L－1)中12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 固相萃取柱對(duì)12種抗生素回收率的影響Fig.2 Effect of solid phase extraction column on recovery of 12 antibiotics

結(jié)果表明：選用C18固相萃取柱時(shí)，喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率明顯偏低，而選用HLB固相萃取柱時(shí)，各目標(biāo)物的回收率普遍更高，這可能是由于喹諾酮類抗生素具有4-氧代喹啉-6-氟-3-羧基結(jié)構(gòu)，親水性較好，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的親脂性較好，而C18固相萃取柱的填料具有疏水特性，適用于萃取、凈化和富集非極性到中等極性的化合物；HLB固相萃取柱的填料為親水親脂型聚合物，適合同時(shí)保留親水性及親脂性化合物，對(duì)不同極性、不同酸堿性化合物均有較好的吸附效果。因此，試驗(yàn)選擇HLB固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行富集。

2.3 洗脫液的選擇

甲醇是分析抗生素時(shí)最常用的洗脫液[1，10，12]。以空白加標(biāo)水樣(加標(biāo)量100 ng·L－1)為研究對(duì)象，分別以10 mL甲醇(分兩次加入)、5 mL甲醇＋5 mL 含2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸的甲醇溶液、10 mL含1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)氨水的甲醇溶液(分兩次加入)為洗脫液，考察了上述洗脫液對(duì)12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 洗脫液對(duì)12種抗生素回收率的影響Fig.3 Effect of eluent on recovery of 12 antibiotics

由圖3可知：當(dāng)選用10 mL 含1%氨水的甲醇溶液(分兩次加入)時(shí)，各目標(biāo)物的回收率均較低；當(dāng)選用10 mL 甲醇(分兩次加入)或5 mL 甲醇＋5 mL含2%甲酸的甲醇溶液時(shí)，各目標(biāo)物的回收率均大于60%，并且前者的回收率略好于后者的?？紤]試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)易，易于標(biāo)準(zhǔn)化，最終選用10 mL甲醇(分兩次加入)為洗脫液。

2.4 水樣體積的選擇

分析水中低濃度水平抗生素時(shí)，除了選用高靈敏度的檢測(cè)儀器外，還需要在前處理過(guò)程中盡可能去除干擾物質(zhì)的同時(shí)合理提高目標(biāo)物的濃縮倍數(shù)。固相萃取柱中的填料隨進(jìn)樣體積的增大逐漸達(dá)到飽和，從樣品溶液開(kāi)始進(jìn)入固相萃取柱的填料床層，到樣品溶液穿透床層開(kāi)始流出，所需的溶液體積被稱為穿透體積。穿透體積越大，所需的水樣量越多，萃取柱對(duì)目標(biāo)物的富集能力越強(qiáng)。以空白加標(biāo)水樣(加標(biāo)量100 ng·L－1)為研究對(duì)象，考察了水樣體積為0.5，1.0，1.5 L 時(shí)對(duì)12 種抗生素回 收率 的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水樣體積對(duì)12種抗生素回收率的影響Tab.2 Effect of water sample volume on recovery of 12 antibiotics

由表2可知：當(dāng)水樣體積為0.5，1.0 L 時(shí)，各目標(biāo)物的回收率為68.5%～95.6%；當(dāng)水樣體積為1.5 L時(shí)，各目標(biāo)物的回收率普遍降低，并且磺胺類抗生素的回收率降低更明顯?？紤]到實(shí)際廢水樣品體積過(guò)大時(shí)，會(huì)造成柱子堵塞，試驗(yàn)選擇水樣體積為0.5 L。

2.5 干擾試驗(yàn)

在去氯自來(lái)水(新鮮自來(lái)水放置3 d，不含余氯)和新鮮自來(lái)水(含余氯)中分別加入適量的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度均為100 ng·L－1，考察了余氯對(duì)12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 余氯對(duì)12種抗生素回收率的影響Fig.4 Effect of residual chlorine on recovery of 12 antibiotics

結(jié)果顯示，對(duì)新鮮自來(lái)水進(jìn)行測(cè)定時(shí)，磺胺類抗生素的回收率較低，而去氯自來(lái)水中磺胺類抗生素的回收率明顯更高，說(shuō)明余氯的存在會(huì)干擾磺胺類抗生素的測(cè)定。

2.6 還原劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[15]，通過(guò)加入還原性物質(zhì)可消除水樣中余氯的干擾。分別以硫代硫酸鈉和抗壞血酸為還原劑，試驗(yàn)考察了上述兩種還原劑對(duì)新鮮自來(lái)水加標(biāo)樣品(加標(biāo)量100 ng·L－1)中12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5(a)。

結(jié)果顯示：當(dāng)以硫代硫酸鈉為還原劑時(shí)，磺胺類抗生素的回收率比不加還原劑時(shí)的顯著升高，而喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率明顯降低，說(shuō)明以硫代硫酸鈉為還原劑時(shí)，會(huì)影響喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測(cè)定；當(dāng)以抗壞血酸為還原劑時(shí)，12種抗生素的回收率均相對(duì)較好。

同時(shí)，試驗(yàn)考察了硫代硫酸鈉和抗壞血酸對(duì)廢水加標(biāo)樣品(加標(biāo)量100 ng·L－1)中12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5(b)。

圖5 還原劑對(duì)12種抗生素回收率的影響Fig.5 Effect of reducing agent on recovery of 12 antibiotics

結(jié)果顯示：與新鮮自來(lái)水基本一致，不加還原劑時(shí)，磺胺類抗生素的回收率較低，這可能是由于廢水成分復(fù)雜，某些組分干擾磺胺類抗生素的測(cè)定；當(dāng)以硫代硫酸鈉為還原劑時(shí)，磺胺類抗生素的回收率明顯升高，但喹諾酮類抗生素的回收率降低；當(dāng)以抗壞血酸為還原劑時(shí)，12種抗生素的回收率均大于60.0%。

在500 mL 廢水樣品中分別加入80，100，150 mg抗壞血酸，進(jìn)一步考察了不同用量的抗壞血酸對(duì)12種抗生素回收率的影響。結(jié)果表明，抗壞血酸用量對(duì)12種抗生素的回收率沒(méi)有明顯影響?？紤]到廢水成分復(fù)雜，為充分消除余氯、過(guò)氧化氫等物質(zhì)的干擾，試驗(yàn)最終選擇在500 mL 廢水樣品中加入150 mg抗壞血酸。

2.7 水樣放置時(shí)間的選擇

用6 mol·L－1鹽酸溶液將500 mL廢水加標(biāo)樣品(加標(biāo)量100 ng·L－1)酸度調(diào)節(jié)至pH2.0，再加入150 mg抗壞血酸和250 mg乙二胺四乙酸二鈉，密封，于4 ℃中保存，考察了水樣放置時(shí)間(1，2，3，7，14 d)對(duì)12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 水樣放置時(shí)間對(duì)12種抗生素回收率的影響Fig.6 Effect of water sample storage time on recovery of 12 antibiotics

結(jié)果顯示：隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分目標(biāo)物的回收率均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)；其中磺胺類抗生素的降低速率較慢，而喹諾酮類與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在7 d后回收率降低明顯。綜合考慮，水樣應(yīng)在3 d內(nèi)分析完畢。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)

在測(cè)定過(guò)程中，樣品中其他物質(zhì)會(huì)干擾目標(biāo)物的離子化過(guò)程，造成離子化抑制或增強(qiáng)，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)(ME)。按照試驗(yàn)方法對(duì)廢水樣品進(jìn)行處理，配制成質(zhì)量濃度為0.40μg·L－1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以初始比例流動(dòng)相為稀釋溶劑，配制成相同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)物在上述兩種溶液中信號(hào)強(qiáng)度的比值計(jì)算ME 值[16-18]，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)ME 值在0.8～1.2內(nèi)時(shí)，表明ME可忽略。

表3 基質(zhì)效應(yīng)Tab.3 Matrix effect

結(jié)果顯示，除SMZ和FLE的ME值略小于0.8以外，其余抗生素的ME 值均在0.8～1.2內(nèi)，說(shuō)明該方法基質(zhì)效應(yīng)不明顯，因此試驗(yàn)采用稀釋溶劑配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，用稀釋溶劑逐級(jí)稀釋，配制成12種抗生素質(zhì)量濃度為2.00，5.00，10.0，20.0，100，200μg·L－1，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50.0μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。以各抗生素與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，12種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為2.00～200μg·L－1，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

重復(fù)7 次空白試驗(yàn)，計(jì)算測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)，以3.143倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢出限(3.143s)，4倍檢出限作為測(cè)定下限，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.4 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.10 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)500 mL空白水樣進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平制備6份，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n=6)

2.11 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)某城市污水處理廠總排口水、某醫(yī)院污水處理設(shè)施出口水、某養(yǎng)殖場(chǎng)地下水、某單位生活污水排口水、某水廠出口水進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。在實(shí)際樣品分析時(shí)，對(duì)于超出線性范圍的樣品進(jìn)行稀釋或濃縮。

表6 樣品分析結(jié)果Tab.6 Analytical results of the samples μg·L-1

結(jié)果顯示：某城市污水處理廠總排口水中，3類抗生素均被檢出，其中OFX 的檢出量達(dá)139μg·L－1；某單位生活污水排口水、某醫(yī)院污水處理設(shè)施出口水和某水廠出口水中，喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素被檢出，但某水廠出口水中的檢出量較低；某養(yǎng)殖場(chǎng)地下水中，僅磺胺類抗生素SMM 被檢出。由此可見(jiàn)，城市及醫(yī)院污水中檢出的喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可能與人體服用抗生素藥物有關(guān)；城市污水處理廠的水源復(fù)雜，檢出的抗生素種類較多；養(yǎng)殖場(chǎng)地下水只檢出磺胺類抗生素，可能與該養(yǎng)殖場(chǎng)使用獸用磺胺類抗生素藥物有關(guān)，說(shuō)明抗生素會(huì)隨動(dòng)物糞尿排出體外，進(jìn)入到環(huán)境中，進(jìn)而在環(huán)境介質(zhì)中富集，對(duì)人體健康帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。

本工作提出了固相萃取-LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定廢水中12種抗生素含量的方法，該方法準(zhǔn)確度好、精密度高，易于推廣應(yīng)用，為廢水中多種抗生素殘留量的分析提供了靈敏、可靠的技術(shù)手段。利用該方法對(duì)5個(gè)不同來(lái)源的廢水樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)污水處理系統(tǒng)不能完全去除廢水中的抗生素，由此帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)需要引起相關(guān)部門的重視。