李順福 王慧敏 房麗莎 劉 震

(河南農(nóng)業(yè)大學林學院 鄭州 450002)

在秋季短日照和低溫誘導下大多數(shù)溫帶多年生木本植物高生長停止，形成休眠芽抵抗冬季的寒冷和干燥，并經(jīng)過低溫解除休眠，在來年春季適時萌發(fā)進行又一輪的生長-休眠的季節(jié)生長發(fā)育周期(永田洋等， 1994； Jianetal.， 1997； 劉震， 2000； Horvathetal.， 2003； 簡令成等， 2004； Olsen， 2010)，休眠芽的發(fā)育決定著該樹種的高度(Perry， 1971)。

泡桐屬(Paulowina)樹種作為我國優(yōu)良的速生樹種，橫跨亞熱帶與暖溫帶，既能適應溫暖濕潤的亞熱帶氣候又能適應冬季較寒冷干燥的暖溫帶氣候，但其頂芽與多數(shù)樹干通直圓滿高大的樹種如楊樹(Populus)(Jianetal., 1997)、山桐子(Idesiapolycarpa)(劉震等， 2000)能夠形成飽滿的休眠芽不同，當年秋季死亡，翌年春季對生側(cè)芽萌發(fā)形成假二叉分枝，導致“冠大干低”(劉震等， 2004)。從20世紀60年代開始，許多學者開展研究探求泡桐頂芽死亡的原因，提出如下原因： 一是冬季低溫脅迫(竺肇華， 1981)，或者低溫到來時泡桐尚未封頂導致未完全木質(zhì)化(蔣建平， 1990)； 二是水分脅迫導致(侯元凱等， 2001)； 三是冬季低溫脅迫和水分脅迫共同作用的結(jié)果(葉金山等， 2009)； 劉震等(2004)在研究泡桐頂側(cè)芽休眠的溫度特性時發(fā)現(xiàn)，在氣溫尚高的9—10月份就發(fā)生死亡，而且頂芽未發(fā)育成飽滿的越冬休眠芽，更不能經(jīng)歷冬季低溫，提出泡桐頂芽死亡是在長期進化過程中獲得的一種生理生態(tài)適應的假說(劉震等， 2004)。為驗證該假說，開展了泡桐高生長停止和死亡過程中頂芽環(huán)境因素調(diào)控、內(nèi)外部形態(tài)、內(nèi)源激素、細胞程序性死亡等方面的研究(王艷梅等， 2009； 2012； 2013； 2016； Wangetal.， 2018； 王國霞等， 2017)，得出18 ℃以上的短日照誘導能使泡桐高生長停止，頂芽不能形成越冬休眠芽而死亡； 頂芽內(nèi)源激素從高生長停止到死亡過程中，ABA、GA、IAA、ZR 4種激素含量均呈下降趨勢，其中ABA的變化明顯不同于一般具有休眠芽的樹種(王艷梅等， 2012)。ABA作為一種抗逆激素，在植物體的積累有助于提高植物的抗性，對多年生植物生長停止和芽的形成與休眠起著重要的調(diào)控作用(Rohdeetal.， 2002)。像泡桐屬一類的樹種為什么不能形成越冬休眠芽，其基因如何調(diào)控頂端分生組織分化而導致頂芽死亡？Wang等(2019)通過短日照誘導毛泡桐20天(Paulowinatomentosa)的轉(zhuǎn)錄組分析，得出晝夜節(jié)律PIF3和PRR5基因上調(diào)表達和生長素信號上IAA、ARF和SAURs基因下調(diào)表達導致泡桐高生長的停止，但20天的短日照處理不能反映頂芽的死亡過程，其轉(zhuǎn)錄組結(jié)果也不能反映頂芽死亡發(fā)生過程中基因調(diào)控的變化。鑒于此，本研究通過延長短日照處理事件到42天，在高生長期、高生長停止期、頂芽死亡發(fā)生期3個時期進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，確定泡桐頂芽死亡發(fā)生過程中差異表達基因，為探究泡桐頂芽死亡分子機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年10月取白花泡桐(Paulowniafortunei)的種子于2017年3月播種在容器中(容器規(guī)格30 cm×28 cm)，取生長狀態(tài)近似的50株分2組于8月放入在河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學林學試驗站(113°38′E，34°47′N)的人工氣候室中恒溫25 ℃下8 h光照/16 h黑暗條件處理，每隔7天對泡桐高生長變化進行測量，并在處理14天(高生長期SDa)、28天(高生長停止期SDb)、42天(頂芽死亡發(fā)生期SDc)進行采樣； 每個時期隨機采3株距頂端0.5 cm左右的泡桐頂芽，放入液氮中，儲存于-80 ℃冰箱中分別用于轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2 RNA提取及文庫構建

樣品在液氮中粉碎后提取RNA，用1%的瓊脂糖電泳檢測樣品是否有降解及雜質(zhì)，用K5500分光光度計(凱奧，北京)檢測樣品純度，用安捷倫2100RNA Nano 6000Assay Kit(Agilent Technologies，CA，USA)檢測樣品的完整性和濃度?？俁NA樣本檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入片段緩沖液使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I繼續(xù)合成cDNA第2鏈，經(jīng)過QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫，洗脫純化后的雙鏈cDNA再進行末端修復、加堿基A、加測序接頭處理，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進行PCR擴增，完成整個文庫制備。構建好的文庫用Illumina平臺進行測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與組裝

測序得到的原始序列raw reads去除接頭污染和低質(zhì)量的序列，去除未知堿基大于5%的序列得到數(shù)據(jù)為clean reads。利用Trinity軟件對clean reads進行de novo拼接組裝獲得轉(zhuǎn)錄本序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene序列。

1.4 差異基因功能注釋分類和代謝通路分析

Unigenes的表達量計算使用RPKM(reads per kilobase per millon mapped reads)，即每百萬reads 中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)，利用DEGSeq2軟件對3個樣品間的Unigenes進行比較，并選取∣log2FoldChange∣≥1且校正P<0.05的基因作為顯著差異表達基因，將差異基因與NR、NT、GO、EggNOG、KEGG、UniProt、Pfam數(shù)據(jù)庫進行比對和功能注釋，用校正P<0.05對差異基因進行GO和KEGG富集分析。

1.5 熒光定量qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組信息和差異基因分析結(jié)果的準確性，隨機選擇11個差異表達基因的Unigenes序列利用Premier 5設計引物，并以白花泡桐18 S核糖體RNA為內(nèi)參基因(曹喜兵， 2014)。以各時期cDNA為模版進行qRT-PCR驗證，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，將提取的RNA用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA的第1條鏈，稀釋100倍后利用SYBRTM Select master Mix(Thermo Fisher公司)進行熒光定量PCR反應(ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀)。qRT-PCR反應條件： 95 ℃預變性3 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。生物學重復3次，技術重復3次，用2-△△Ct法計算相對表達量。結(jié)果用IBM SPSS Statistics 19 軟件分析，OriginPro 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 短日照對白花泡桐外部形態(tài)的影響

在25 ℃恒溫的人工氣候室中，用短日照(8 h光照/16 h黑暗)處理14天，株高不斷增加，頂端和幼葉呈現(xiàn)嫩綠色，表面密生白色腺毛，處于高生長期(SDa)； 處理28天，株高不再增加，頂端顏色由嫩綠色變?yōu)樯罹G色并不再萌發(fā)新的幼葉，處于高生長停止期(SDb)； 處理42天，頂端幼葉脫落，頂芽萎縮變小變褐色，頂芽下端出現(xiàn)斷痕，處于頂芽死亡發(fā)生期(SDc)(圖1)。

圖1 短日照處理下白花泡桐株高和頂芽狀態(tài)

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及結(jié)果

用Illumina平臺對SDa、SDb、SDc 3個時期(每個時期3個生物學重復)共9個樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，共測得57.47 Gb的原始數(shù)據(jù)。過濾后的clean reads的Q30都在92.85%以上，GC含量約為42.25%，每組數(shù)據(jù)情況見表1。

2.3 差異基因分析

對3個時期測序結(jié)果進行比較，選取∣log2FoldChange∣ ≥1且校正P< 0.05的基因作為顯著差異表達基因，共篩選出44 937個差異基因，其中有37 076條(83.51%)基因在7大數(shù)據(jù)庫中被注釋(表2)。SDb和SDa顯著差異的基因為13 378條，其中上調(diào)表達9 923條，下調(diào)表達3 455條； SDc和SDb顯著差異的基因為25 341條，其中上調(diào)表達16 879條，下調(diào)表達8 462條； SDc和SDa顯著差異的基因33 056條，上調(diào)表達25 640條，下調(diào)表達7 416條； 3個時期差異基因共同上調(diào)的基因1 730條，共同下調(diào)的基因441條(圖2)。

表1 短日照誘導白花泡桐頂芽3個時期reads 質(zhì)量統(tǒng)計

表2 差異基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計

圖2 短日照誘導下3個時期差異表達基因數(shù)(A)及分布情況(B)

2.4 差異基因GO功能富集分析

對3個時期的差異基因進行注釋后，將注釋成功的基因按照GO的3大類： 生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)，進行分類。對分類中差異基因的數(shù)目進行超幾何檢驗，用校正P<0.05找到差異表達基因中顯著富集的GO條目(圖3)，發(fā)現(xiàn)3個時期富集到GO上的差異基因趨勢基本一致，其中富集到細胞組分的差異基因最多的3個亞類是細胞成分、細胞器和細胞器組分； 富集到生物學過程的差異基因最多的3個亞類為細胞過程、代謝過程和生物調(diào)控； 富集到分子功能的差異基因最多的3個亞類為結(jié)合活性、催化活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

圖3 不同時期差異表達基因GO聚類分析

2.5 差異基因的KEGG富集通路分析

將白花泡桐頂芽3個時期差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫分析，以校正P<0.01為標準對代謝通路進行富集分析： 在短日照處理中其中SDb vs SDa涉及的代謝通路為134條，富集到的通路為8條，富集程度最高的3個通路分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導，角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟的合成及光合作用天線蛋白通路； SDc vs SDb涉及到的代謝通路為133條，其中富集到的通路為4條，富集程度最高的3個通路分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導、氨基酸合成、淀粉和蔗糖代謝通路； SDc vs SDa涉及到的代謝通路為135條，富集到的代謝通路為10條，富集程度最高的3個通路分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導、淀粉和蔗糖代謝及苯丙烷類合成通路(表3)。

2.6 植物激素調(diào)控通路的差異基因分析

通過對白花泡桐頂芽KEGG代謝通路的富集分析，得出植物激素信號轉(zhuǎn)導通路在3個時期都有顯著富集并且富集程度最高。在植物激素信號轉(zhuǎn)導通路上共篩選出30個差異基因，其中在生長素(IAA)信號轉(zhuǎn)導途徑中生長素響應因子ARF、IAA、GH3和SAUR在SDb和SDc均下調(diào)表達； 細胞分裂素(CTK)信號轉(zhuǎn)導途徑中的ARR-B家族因子在SDb上調(diào)表達，在SDc下調(diào)表達； 赤霉素(GA)信號轉(zhuǎn)導途徑的DELLA有2個差異基因在SDb和SDc均為下調(diào)表達； ABA信號轉(zhuǎn)導途徑的相關的蛋白磷酸酶2C(PP2C)在SDb和SDc為上調(diào)表達，蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK2和ABF的3個差異基因在SDb均表現(xiàn)為上調(diào)表達，在SDc均出現(xiàn)下調(diào)表達； ETH轉(zhuǎn)導通路的正調(diào)控因子EIN2和EIN3在SDb出現(xiàn)上調(diào)表達，在SDc下調(diào)表達； 反應元件結(jié)合蛋白ERF1的2個差異基因在SDb和SDc均上調(diào)表達； BR信號轉(zhuǎn)導通路上的編碼木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的TCH4在SDc出現(xiàn)了上調(diào)表達，細胞周期蛋白CYCD3在SDb下調(diào)表達，在SDc上調(diào)表達(圖4、表4)。

2.7 差異表達基因的qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組信息和差異基因分析結(jié)果的準確性，以白花泡桐18 S核糖體RNA為內(nèi)參基因，選取激素信號轉(zhuǎn)導通路和光合作用通路上的11個差異基因進行qRT-PCR(表5)，用差異基因在不同樣品間的差異倍數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn)這11個差異基因在不同樣品中的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的表達結(jié)果趨勢基本一致(圖5)。

表3 差異表達基因KEGG富集通路分析

表4 富集到植物激素信號轉(zhuǎn)導KEGG通路上差異基因及功能描述①

續(xù)表 Continued

圖4 短日照誘導下激素轉(zhuǎn)導KEGG通路及相關基因表達熱圖

表5 選取qRT-PCR驗證的基因編號和引物序列

圖5 qRT-PCR和RNA-Seq在3組樣品間差異倍數(shù)的比對

3 討論

通過對短日照誘導白花泡桐14天(SDa： 高生長期)、28天(SDb： 高生長停止期)、42天(SDc： 頂芽死亡發(fā)生期)的轉(zhuǎn)錄組分析，共篩選出44 937個差異基因，其中顯著差異的基因25 341條，SDc vs SDb中涉及到的KEGG代謝通路為133條，富集的通路4條分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導、氨基酸合成、淀粉和蔗糖代謝和苯丙氨酸等合成通路，未發(fā)現(xiàn)Wang等(2019)短日照誘導毛泡桐中晝夜節(jié)律通路上差異基因的富集。植物芽休眠本質(zhì)是莖端分生組織分裂活動的相對靜止，植物激素起著重要的調(diào)控作用，不同的激素對休眠的影響不同(Cookeetal.， 2012)，SDc vs SDb的差異基因在KEGG上主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導通路，并從中篩選出30個差異基因進行分析。

ABA是植物芽休眠建立和維持的必需激素，在其信號轉(zhuǎn)導過程中，ABA與受體PYL結(jié)合后與蛋白磷酸酶2C(PP2C)形成復合體抑制PP2C的功能，導致有活性的SnRK2蛋白水平增加，最終激活ABA響應基因的表達(Hubbarbetal.， 2010)。在短日照誘導楊樹(Ruttinketal.， 2007)、沙梨(Pyruspyrifolia)(Lietal.， 2018)等高生長停止和芽休眠過程中ABA含量升高，其響應因子ABF均上調(diào)表達來建立和維持休眠； 本研究白花泡桐在SDb中SnRK2和ABF為上調(diào)表達，但在SDc中SnRK2和ABF卻為下調(diào)表達，SDc中相關的響應因子表達與楊樹(Ruttinketal.， 2007)和沙梨(Lietal.， 2018)芽休眠過程中不同； 同時對泡桐1年生苗木的激素測定得出ABA的含量從高生長停止到死亡發(fā)生呈現(xiàn)上升后下降趨勢(王艷梅等， 2012)，這與SDc中的響應因子ABF表達趨勢一致。因此白花泡桐在SDc中ABA響應因子ABF下調(diào)表達，可能是導致其高生長停止后無法形成和維持休眠芽而導致頂芽死亡的主要原因。

ETH對植物器官的成熟和衰老有重要的調(diào)節(jié)作用，是葉片脫落的重要物質(zhì)(Johnsonetal.， 1998)。在ETH激素信號轉(zhuǎn)導途徑中，ETH與受體ETR結(jié)合后與負調(diào)控因子CTR1相互作用，抑制EIN2轉(zhuǎn)錄元件激活后調(diào)控下游EIN3轉(zhuǎn)錄因子，從而結(jié)合ETH響應因子ERF啟動子介導下游基因的表達(Lietal.， 2015)。ETH的響應因子在植物休眠中也起一定的調(diào)節(jié)作用，在短日照誘導垂枝樺(Betulapendula)(Ruonalaetal.， 2006)和楊樹(Ruttinketal.， 2007)高生長停止和休眠芽形成階段ETH響應因子都出現(xiàn)短暫的上調(diào)表達，在白花泡桐SDb中EIN2、EIN3和ERF1也出現(xiàn)上調(diào)表達，此時高生長停止； 在楊樹(Ruttinketal.， 2007)芽休眠期ERF1為下調(diào)表達，而在白花泡桐SDc中ERF1出現(xiàn)上調(diào)表達，此時頂端分生組織分化的葉原基展開的幼葉先于成熟葉片脫落，無法形成芽鱗包裹葉原基的休眠芽，ERF1的上調(diào)表達可能導致白花泡桐無法形成具有保護組織的越冬休眠芽。

BR激素在細胞伸長和分裂中起著重要的調(diào)節(jié)作用(Wangetal., 2014)。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中BR激素信號轉(zhuǎn)導通路上的TCH4基因編碼木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶，影響細胞壁的形成和擴展從而導致細胞伸長(Xuetal.， 1995)； 但TCH4在白花泡桐SDc中出現(xiàn)了上調(diào)表達，其他時期不表達。CYCD3是調(diào)控細胞周期完成細胞分裂的重要元件，調(diào)控細胞分裂的G1-S期和G2-M期(Gutierrezetal.， 2002; den Boeretal.， 2000)，在楊樹休眠芽中細胞分裂停止在G1期(Rohdeetal.， 1997)，其頂端分生組織細胞分裂活動相對停滯，相應細胞周期也進入不活躍狀態(tài)，CYCD3下調(diào)表達(Ruttinketal.， 2007)； 白花泡桐在高生長停止的SDb中CYCD3出現(xiàn)下調(diào)表達，但在SDc中卻為上調(diào)表達，這表明白花泡桐頂端分生組織細胞在頂芽死亡發(fā)生期分裂活動仍在繼續(xù)進行。TCH4和CYCD3上調(diào)表達導致白花泡桐頂端分生組織細胞的活躍從而不能形成正常的休眠芽。

IAA是植物生長必需激素，在植物芽休眠過程中含量急劇下降，白花泡桐在SDb和SDc中IAA響應因子ARF、IAA、GH3和SAUR均下調(diào)表達，這與Wang等(2019)在短日照誘導毛泡桐高生長停止期和Ruttink等(2007)誘導楊樹休眠期的表達趨勢一致； GA與芽休眠的解除有關，在芽休眠過程中含量下降，其中DELLA蛋白是GA信號轉(zhuǎn)導傳遞的關鍵元件，白花泡桐在SDc中DELLA下調(diào)表達，這與沙梨在休眠期的DELLA表達趨勢(劉杭等， 2016)一致。因此，得出白花泡桐在頂芽死亡發(fā)生期(SDc)IAA和GA信號轉(zhuǎn)導通路上相關的響應因子的表達與楊樹等木本植物休眠期的表達趨勢一致，而ABA、ETH和BR上相關響應因子的表達趨勢不同。

4 結(jié)論

短日照誘導白花泡桐高生長停止初期，ABA和ETH的響應因子出現(xiàn)上調(diào)表達，IAA、GA和BR信號轉(zhuǎn)導通路上相關基因下調(diào)表達，促使高生長停止，但隨著短日照誘導時期的延長，ABA的響應因子ABF卻出現(xiàn)下調(diào)表達，BR信號轉(zhuǎn)導通路上的TCH4和CYCD3上調(diào)表達，導致頂端分生組織細胞的分裂活動仍繼續(xù)進行，同時ETH響應因子ERF1出現(xiàn)上調(diào)表達，可能導致分生組織分化的葉原基展開的幼葉脫落而無法形成芽鱗包裹，使白花泡桐頂芽不能向形成越冬休眠芽方向發(fā)展而死亡。