叢 微 于晶晶 喻海茫 丁 易 張于光

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護研究所 國家林業(yè)和草原局生物多樣性保護重點實驗室 北京 100091； 2.湖南省長沙縣職業(yè)中專學(xué)校 長沙 410142)

土壤微生物作為分解者可將地上植物群落和生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)緊密地聯(lián)系起來，顯著影響生態(tài)系統(tǒng)功能。較高的微生物多樣性能夠增強養(yǎng)分交換和資源互補利用，改善植物獲取養(yǎng)分的能力和提高生產(chǎn)力(Tedersooetal.， 2020)。此外，土壤微生物在影響溫室氣體排放以及改善土壤污染等方面也具有重要作用(Sutkaetal., 2003； Xuetal.， 2015)。土壤生物多樣性的減少或喪失、群落組成的簡化明顯削弱了生態(tài)系統(tǒng)功能，例如在植物多樣性、養(yǎng)分利用、養(yǎng)分循環(huán)和物質(zhì)降解等方面(Waggetal.， 2014)。

隨著分子生物學(xué)發(fā)展和進步，研究者對土壤微生物多樣性分布規(guī)律從局域水平、區(qū)域水平以及全球尺度等不同空間尺度進行研究。目前，對影響土壤微生物群落空間分布模式的關(guān)鍵因素仍存在較大爭論，環(huán)境因子(如土壤pH值、植被類型)是影響微生物空間分布的主要因素(Shietal.， 2018； Tedersooetal.， 2014)，而在區(qū)域尺度下，歷史進化因素決定了土壤微生物多樣性(Geetal.， 2008)。此外，Hanson等(2012)提出了土壤微生物的分布由選擇、漂變、擴散和突變以及它們相互作用共同決定。因此，土壤微生物群落空間分布的差異，可能是由研究尺度或微生物群落所處環(huán)境及歷史進化因素不同所導(dǎo)致。

深入認識森林土壤微生物多樣性及其對環(huán)境變化的響應(yīng)，可為森林生態(tài)系統(tǒng)管理提供科學(xué)依據(jù)。本研究以4種不同氣候帶的森林土壤細菌和真菌為對象，即溫帶針葉林、暖溫帶針闊混交林、亞熱帶常綠落葉闊葉混交林、熱帶雨林，在較大空間尺度分析森林土壤微生物多樣性和群落構(gòu)建特征。主要探討的問題包括： 1)不同氣候帶森林土壤細菌和真菌群落的組成及其分布模式； 2)森林土壤細菌和真菌的群落構(gòu)建特征和異同； 3)影響不同氣候帶森林微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

1 材料與方法

1.1 樣地設(shè)置與土壤樣品采集

選擇溫帶針葉林(新疆喀納斯國家級自然保護區(qū)、新疆庫爾德寧西天山保護區(qū)，以下簡稱KNS、KEDN)、暖溫帶針闊混交林(甘肅小隴山林區(qū)，以下簡稱GS)、亞熱帶常綠落葉闊葉混交林(湖北木林子保護區(qū)，以下簡稱HB)和熱帶雨林(海南霸王嶺保護區(qū)，以下簡稱HN)4種氣候帶森林為研究對象。KNS主要樹種為西伯利亞紅松(Pinussibirica)、西伯利亞云杉(Piceaobovata)和西伯利亞落葉松(Larixsibirica)； KEDN主要樹種為天山云杉(Piceaschrenkianavar.tianschanica)； GS主要樹種為銳齒槲櫟(Quercusalienavar.acuteserrata)、白樺(Betulaplatyphylla)和小葉烏藥(Linderaaggregatevar.playfairii)； HB主要樹種為翅柃(Euryaalata)、多脈青岡(Cyclobalanopsismultinervis)、川陜鵝耳櫪(Carpinusfargesiana)和小葉青岡(Cyclobalanopsismyrsinaefolia)； HN主要樹種為陸均松(Dacrydiumpierrei)、刺栲(Castanopsishystrix)和五列木(Pentaphylaxeuryoides)(表1)。

在已建立的固定樣地(每個6 hm2)采集土壤樣品，按十字形布點方式在每個樣地內(nèi)隨機選擇17個20 m×20 m樣方，在距離樹干1 m以上的區(qū)域用土鉆(直徑3 cm)取樣，每個樣方內(nèi)鉆取16鉆0～20 cm土壤并混合，過2 mm孔篩除去凋落物和碎石等。土壤樣品分成2部分放入標(biāo)記好的自封袋中，一部分保存在4 ℃冰箱中，用于土壤養(yǎng)分和理化性質(zhì)分析； 一部分保存在-20 ℃冰箱中，用于土壤DNA測定分析。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定和植物調(diào)查

測定土壤理化性質(zhì)，包括土壤含水量、pH值、有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、速效鉀、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量(鮑士旦， 2000)。

在每個樣方內(nèi)調(diào)查胸徑≥1 cm的木本植物，記錄其胸徑、樹高、坐標(biāo)、種名等，并計算植物物種豐富度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、功能離散度和胸高斷面積(路興慧等， 2015)。

1.3 土壤微生物DNA提取及測序

通過PowerSoil試劑盒(QIAGEN，德國)提取土樣總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，NanoDrop2000檢測提取的DNA溶液濃度和純度。使用16S rRNA基因引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌V3-V4區(qū)(Morietal.， 2014)。使用真菌ITS引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和TIS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對真菌ITS1區(qū)擴增(Adamsetal.， 2013)。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司，美國)回收PCR產(chǎn)物，并用Tris_HCl洗脫和2%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。通過MiSeq PE300平臺進行測序(美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，上海)。

測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)利用Trimmomatic、FLASH軟件進行拼接以及質(zhì)控過濾(Bolgeretal.， 2014； Magoetal.， 2011)。非重復(fù)序列(不含單序列)利用Usearch軟件進行OTU聚類，去除嵌合體得到OTU代表序列，并按照97%的序列相似性進行劃分(Edgar， 2013)； 基于RDP classifier貝葉斯算法，在各分類水平上統(tǒng)計每個樣地的群落組成(Wangetal.， 2007)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

土壤微生物α-多樣性由香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)表征，基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)方法分析微生物群落組成的異質(zhì)性。典范對應(yīng)分析(cannoical correspondence analysis, CCA)和Mantel test方法分析影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，其中CCA分析選擇VIF值<20的環(huán)境因子?；诹隳Ｐ头椒ǚ治鑫⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)的構(gòu)建過程(Zhouetal.， 2017)。數(shù)據(jù)分析基于R Studio(v.3.4.3)中的vegan包或Galaxy-DengLab分析平臺(http:∥mem.rcees.ac.cn:8080)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

不同氣候帶森林土壤理化性質(zhì)見表1。各地點的土壤含水量均在20%以上，且呈酸性或弱酸性。KEDN樣地具有較高的土壤有機質(zhì)、全氮、全磷和水解性氮，這表明暖溫帶針葉林KEDN的土壤養(yǎng)分較高。植物香農(nóng)指數(shù)在不同氣候帶差異顯著(P<0.05)，主要表現(xiàn)為植物多樣性在熱帶雨林中最高，其次是暖溫帶針闊混交林，暖溫帶針葉林中最低。HN和KEDN樣地胸高斷面積顯著高于其他樣地(P<0.05)，這表明其具有較高生物量。

表1 研究樣地的土壤性質(zhì)和植物多樣性及其功能性狀①

2.2 土壤微生物的物種組成

基于Illumina測序結(jié)果，共得到9 081個細菌物種OTU，屬于30個門和502個屬。在門水平(圖1a)，變形菌門(Proteobacteria)占33.54%、酸桿菌門(Acidobacteria)占27.55%、放線菌門(Actinobacteria)占17.11%、綠彎菌門(Chloroflexi)占3.19%，共占群落組成的81.39%。在5個研究地點中，變形菌門和酸桿菌門在HN樣地中的相對豐度最高，各占HN群落組成的40.23%和33.51%。在屬水平(圖1b)，共有14個屬相對豐度>1%，其中慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)占6.76%，在KNS樣地相對豐度最高；Gp6是KEDN和GS樣地優(yōu)勢屬，分別占11.24%、10.84%；Gp2是HB與HN樣地的優(yōu)勢屬，分別占10.13%、10.00%。

土壤真菌共得到16 107個OTU，主要歸屬為5個門類(圖2a)，分別為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占48.51%、子囊菌門(Ascomycota)占40.66%、接合菌門(Zygomycota)占8.33%、壺菌門(Chytridiomycota)占0.17%、球囊菌門(Glomeromycota)占0.16%，共占群落組成的97.84%。不同氣候帶的森林土壤其優(yōu)勢真菌不同，溫帶針葉林的優(yōu)勢菌是子囊菌門(KNS占55.66%； KEDN占53.82%)，暖溫帶針闊混交林(GS占53.88%)、亞熱帶常綠落葉闊葉混交林(HB占67.02%)、熱帶雨林(HN占57.69%)的優(yōu)勢菌是擔(dān)子菌門。在屬水平，共得到785個屬，除去未分類的屬后共有12個屬相對豐度>1%(圖2b)，其中Archaeorhizomyces屬是KNS樣地的優(yōu)勢屬(22.60%)，被孢霉屬(Mortierella)是KEDN樣地的優(yōu)勢屬(16.93%)，絲膜菌屬(Cortinarius)是GS的優(yōu)勢屬(11.20%)，紅菇屬(Russula)分別是HB(29.19%)和HN(13.79%)的優(yōu)勢屬。

圖1 不同氣候帶森林土壤細菌主要門(a)和屬的相對豐度(b)

圖2 不同氣候帶森林土壤真菌主要門(a)和屬(b)的相對豐度

2.3 土壤微生物多樣性

香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)用來表征土壤微生物群落的α-多樣性，結(jié)果表明，各樣地細菌香農(nóng)指數(shù)具有顯著差異(P<0.05)，而KNS和HN樣地的豐富度指數(shù)無顯著差異，但香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)在暖溫帶針闊混交林(GS)樣地最高，在溫帶針葉林和熱帶雨林樣地最低，細菌多樣性在沿氣候梯度的5個地點中總體呈現(xiàn)單峰模式分布(圖3)。

各樣地土壤真菌多樣性分布差異不大(圖4)，其中KEDN香農(nóng)指數(shù)顯著高于HN(P<0.05)； HN豐富度指數(shù)顯著高于KNS和HB(P<0.05)?；贐ray-Curtis距離，利用NMDS分析發(fā)現(xiàn)細菌和真菌的群落組成在物種水平上均有顯著差異(圖5)。

圖3 不同氣候帶森林的土壤細菌多樣性指數(shù)分布特征

2.4 土壤微生物的群落構(gòu)建特征

基于零模型方法，分析確定性過程與隨機性過程在不同氣候帶土壤微生物群落構(gòu)建中的相對重要性。結(jié)果表明(表2)，勻質(zhì)性選擇(homogeneous selection)對各樣地細菌群落構(gòu)建過程影響較大，具體為： 在KNS樣地中占74.26%，KRDN樣地中占52.94%，GS樣地中占51.47%，HB樣地中占92.65%，HN樣地中占77.94%。因此，在土壤細菌群落構(gòu)建過程中，確定性過程的相對貢獻(52.94%～92.65%)顯著高于隨機性過程(7.35%～47.06%)。

未知主導(dǎo)的隨機過程(undominated)，包括弱選擇(weak selection)、弱擴散(weak dispersal)、分化(diversification)和漂變(drift)等過程對KNS(49.26%)、KEDN(36.76%)和HN(50.74%)3個樣地的真菌群落影響較大。擴散限制(75.00%)對GS真菌群落構(gòu)建影響較大， 勻質(zhì)性選擇(51.47%)對HB真菌群落構(gòu)建影響更大。因此，在土壤真菌群落構(gòu)建過程中，隨機性過程的相對貢獻(48.53%～90.44%)顯著高于確定性過程(9.56%～51.47%)。

分析不同氣候帶森林土壤細菌群落和真菌群落結(jié)構(gòu)的構(gòu)建過程后發(fā)現(xiàn)，細菌群落構(gòu)建主要受確定性因素影響； 而真菌群落結(jié)構(gòu)由確定性過程和隨機性過程影響，但隨機性過程影響更大。

圖4 不同氣候帶的森林土壤真菌多樣性指數(shù)分布特征

圖5 土壤細菌(a)和真菌(b)群落的NMDS分析

表2 決定性過程和隨機性過程對土壤微生物群落的貢獻率

2.5 影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子

利用CCA和Mantel test分析了影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因素。CCA分析共得到9個環(huán)境因子(圖6)，包括土壤pH值、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、植物香農(nóng)指數(shù)和植物功能離散度。根據(jù)環(huán)境因子在CCA1軸的投影長度可知，土壤pH值、全磷和植物香農(nóng)指數(shù)是影響細菌群落組成的重要因子(圖6a)； 土壤pH、全磷、植物香農(nóng)指數(shù)和全鉀是影響真菌群落組成的重要因子(圖6b)。利用Mantel test分析(表3)表明，細菌群落受土壤pH值的影響最大(r=0.826，P<0.001)，植物物種數(shù)和土壤全磷次之； 而真菌群落受植物物種數(shù)的影響最大(r=0.474，P<0.001)，土壤pH值和植物香農(nóng)指數(shù)次之。

圖6 土壤細菌群落(a)和真菌群落(b)與環(huán)境因子間的典范對應(yīng)分析

表3 土壤細菌和真菌與環(huán)境因子的Mantel test分析

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，土壤細菌優(yōu)勢菌群在不同生態(tài)系統(tǒng)中基本相似，例如變形菌門、酸桿菌門和放線菌門在高寒草甸土壤(劉曉,2016)、森林土壤(Zhangetal.， 2016)以及農(nóng)田土壤(Shietal.， 2018)中占有主要地位。本研究中，5個地點的主要細菌門類大致相同，為變形桿菌門、酸桿菌門和放線菌門，HN樣地中變形菌和酸桿菌的相對豐度較高，在KEDN放線菌門相對豐度最高； 在屬水平，各樣地優(yōu)勢屬存在差異，Brodyrhizobium屬在KNS樣地相對豐度最高，Gp6屬在KEDN與GS相對豐度最高，Gp2屬在HB和HN樣地相對豐度最高。研究發(fā)現(xiàn)變形菌門相對豐度與土壤碳、氮具有正相關(guān)關(guān)系(Zhangetal.， 2014)。

多數(shù)研究認為土壤酸桿菌相對豐度與土壤pH值呈負相關(guān)(Chuetal.， 2010； Griffithsetal.， 2011)，或無顯著相關(guān)性(Liuetal.， 2015)，也可能是其他土壤因子相關(guān)(Navarreteetal.， 2013)，這可能是不同亞群酸桿菌或同一亞群不同細菌對土壤因子的響應(yīng)不同(王光華等， 2016)。本研究中，KEDN放線菌相對豐度最高，這可能由于該樣地具有較高的土壤碳、氮和生物量。土壤真菌群落的優(yōu)勢類群為擔(dān)子菌門、子囊菌門和接合菌門，這與之前研究結(jié)果相似(Liuetal.， 2018； Silesetal.， 2016)，但土壤真菌群落組成在各研究地點存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，子囊菌門為溫帶針葉林優(yōu)勢菌群，擔(dān)子菌門為暖溫帶針闊混交林、亞熱帶常綠落葉闊葉混交林和熱帶雨林優(yōu)勢菌群。這可能與土壤凋落物較少或針葉林凋落物較難降解，導(dǎo)致氮輸入較低有關(guān)；也可能由于子囊菌對氣候因子(如降水或溫度)較敏感，且土壤pH值對子囊菌類群Pezizomycetes也有影響(Tedersooetal.， 2014)。

大多研究認為土壤因子和植被是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。Nielsen等(2010)發(fā)現(xiàn)土壤性質(zhì)變化對細菌群落和古菌群落有較強影響，而真菌群落與植物存在更密切關(guān)系。土壤pH值是影響土壤細菌多樣性的主要因素(Griffithsetal.， 2011； Lauberetal.， 2009； Liuetal.， 2018)。本研究中，土壤細菌多樣性在暖溫帶針闊混交林最高，這與Bahram等(2018)研究一致，即發(fā)現(xiàn)在全球表層土壤中，土壤細菌多樣性在溫帶最高，隨緯度梯度呈單峰分布。根據(jù)CCA和Manel test可知，土壤細菌群落與土壤pH值存在顯著相關(guān)性，土壤pH值對細菌多樣性的影響更大(r=0.826)。這可能由于細菌生長的最適pH值范圍較窄(Rousketal.， 2010)，大多數(shù)細菌適宜在pH值6.5—7.5的環(huán)境中生長(徐志偉， 2015)，而在酸性土壤中其多樣性較低(Fiereretal.， 2006)。

Shi等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，在植物多樣性最低的森林系統(tǒng)中真菌表現(xiàn)出較高的多樣性，這可能由于在多樣性較低的森林系統(tǒng)中真菌出現(xiàn)了高度的物種形成(Tedersooetal.， 2014)。多數(shù)真菌更偏好溫暖潮濕、需氧和酸性的環(huán)境，以獲得生長繁殖所需要的有機物和含氮化合物，且溫度較高的地區(qū)其植物種類較豐富，具有較高的初級生產(chǎn)力和分解速率，因此微生物豐富度在熱帶地區(qū)更高(Waggetal.， 2014； Liangetal.， 2016)。Tedrrsoo等(2014)認為真菌豐富度與植物間的相關(guān)性并不是植物對真菌的直接影響，而是它們對氣候和土壤因子的相似響應(yīng)。植物對土壤微生物的影響主要表現(xiàn)為兩個方面，一是通過改變土壤結(jié)構(gòu)和土壤性質(zhì)使微生物的生長環(huán)境發(fā)生變化，二是根系分泌物對微生物的影響(徐志偉， 2015)。土壤pH值對真菌群落的影響可能是直接或間接影響其他相關(guān)因子，如鈣和其他陽離子濃度(Bahrametal.， 2018)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，土壤全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮與土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)也存在相關(guān)性。這在其他研究中也有相似結(jié)論，如Horner-Devine等(2004)發(fā)現(xiàn)土壤磷酸鹽和銨離子濃度變化影響細菌群落組成；丁建莉(2017)發(fā)現(xiàn)土壤真菌群落與速效鉀、硝態(tài)氮和速效磷相關(guān)性較高。這可能是不同真菌類群對特定土壤條件表現(xiàn)出不同的偏好(Tedersooetal.， 2014)。

確定性過程和隨機性過程是微生物群落構(gòu)建的2個主要生態(tài)過程。然而，隨著地理尺度、生境和物種類型的不同，對微生物群落的相對影響可能會不同(Xiongetal.， 2012； Bardgettetal.， 2014； Wangetal.， 2016)。以往研究認為，環(huán)境選擇對微生物群落的影響要大于擴散限制的影響(Finlayetal.， 2002)。Wang等(2016)認為環(huán)境選擇對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響占主導(dǎo)地位，而擴散限制的作用則依賴于物種，如繁殖體形狀和大小以及對紫外線敏感性，可能會對物種間長距離擴散產(chǎn)生不同影響(Finlayetal.， 2002)。也有研究發(fā)現(xiàn)，真菌群落的生物地理差異可能受到氣候因素和不同分布地區(qū)寄主植物與真菌間營養(yǎng)聯(lián)系的影響(Tedersooetal.， 2014)，如Itan等(2016)發(fā)現(xiàn)塵埃降雨將多種真菌群落從北非傳遞到地中海東部； EcM和病原真菌直接通過寄主植物獲取大部分碳，而腐生真菌更依賴土壤有機質(zhì)(Plettetal.， 2011)； Bahram等(2015)發(fā)現(xiàn)環(huán)境梯度較窄和空間距離較小會增加隨機過程的影響。本研究中，土壤細菌群落由確定性過程主導(dǎo)，真菌群落由確定性過程和隨機性過程決定，且隨機性過程更重要。

4 結(jié)論

我國溫帶、暖溫帶、亞熱帶和熱帶森林土壤的細菌和真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)都存在顯著差異，其中土壤細菌多樣性具有顯著差異，在沿緯度分布的5個研究地點中呈單峰模式分布，即在暖溫帶針闊混交林中最高； 土壤真菌香農(nóng)指數(shù)在溫帶針葉林中最高，土壤真菌豐富度在熱帶雨林中最高。土壤細菌和真菌具有不同的群落構(gòu)建特征，其中不同氣候帶的森林土壤細菌群落主要由確定性過程主導(dǎo)，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)主要受隨機性過程影響。土壤pH值和植物多樣性是影響森林土壤微生物多樣性的重要因素，其中pH值是影響細菌多樣性的重要因素，pH值、植物多樣性是影響真菌多樣性的重要因素。