葛鑫會，孟繼坤，張 楠，苗雨欣，張秀清

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100089）

食用菌具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，是多酚、多糖、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)的良好來源，由于其多酚類化合物具有較高的抗氧化、抗腫瘤、抗炎等生物活性[1-2]，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。五臺山位于山西省東北部忻州市，其海拔高、地溫低且土質(zhì)肥沃、富含有機(jī)質(zhì)，具有豐富的野生生物資源，臺蘑作為當(dāng)?shù)氐奶厣秤镁哂袪I養(yǎng)豐富、香味濃郁、味道鮮美等特性，五臺山地區(qū)特殊的地理位置和生態(tài)環(huán)境為臺蘑的生長創(chuàng)造了良好的條件[3]。已有研究表明臺蘑富含多種氨基酸、維生素，且具有較高的蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值高于茶樹菇（Agrocybe aegerita）和香菇（Lentinus edodes）[4]。

臺蘑以“香蕈”和“銀盤”著名，其品種主要包括以下幾類[3-5]：白樁菇（Leucopaxillus candidus），即白銀盤；五臺杯傘（Clitocybe wutaishanensis），又稱雞爪香蕈；粉紫香蘑（Lepista personata）；紫丁香蘑（Lepista nuda），又稱小香蕈；香杯傘（Clitocybe odora），又稱水皮。

食用菌中酚類化合物已成為醫(yī)藥和食品工業(yè)中天然抗氧化劑的重要來源[6]。Islam等[7]以DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力為指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，43種食用菌均具有顯著的抗氧化活性。Garrab等[8]研究證明，不同食用菌的甲醇和乙酸乙酯提取物具有高抗氧化活性，主要是由于其多酚含量較高。目前，對于五臺山地區(qū)的野生食用菌研究多集中于香蕈類的營養(yǎng)成分組成及液體發(fā)酵培養(yǎng)，臺蘑酚類物質(zhì)組成分析及其抗氧化活性研究鮮見報(bào)道。

基于此，通過測定香杯傘、五臺杯傘和紫丁香蘑3種常見野生臺蘑的總酚和總黃酮含量，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS） 技術(shù)對3種臺蘑酚類物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，探究其酚類物質(zhì)的組成，進(jìn)一步進(jìn)行抗氧化活性測定，為臺蘑資源的營養(yǎng)價(jià)值開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香杯傘、五臺杯傘、紫丁香蘑3種野生臺蘑均采自山西省忻州市五臺山。

標(biāo)準(zhǔn)品：沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、水楊酸、肉桂酸、槲皮素、兒茶素均為色譜純，純度≥98%，購自北京索萊寶科技有限公司；DPPH，購自美國Sigma公司；總抗氧化能力試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810PU紫外可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器廠；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州貝楷儀器設(shè)備有限公司；TG16-WS臺式離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UPLC-MS/MS超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 臺蘑總酚、總黃酮含量的測定

1） 樣品前處理

參照Cheung[9]方法略作改動(dòng)，將干制的香杯傘、五臺杯傘、紫丁香蘑3種臺蘑樣品采用粉碎機(jī)打碎，過40目篩。準(zhǔn)確稱取3種臺蘑粉各4 g于250 mL平底燒瓶中，加入70%乙醇100 mL，于50℃用冷凝回流裝置提取1.5 h,4 000 r·min-1離心20 min，將提取液在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮蒸干，用甲醇定容至5 mL，儲存于-20℃以備后續(xù)測定。

2） 總酚含量測定

參照Ismail等[10]方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林-酚法測定總酚含量。得到的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)中沒食子酸的質(zhì)量。

3）總黃酮含量測定

參照Ismail等[10]方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁比色法測定總黃酮含量。得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.997 7，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)中蘆丁的質(zhì)量。

1.3.2 臺蘑酚類物質(zhì)的UPLC-MS/MS分析

1） 樣品前處理

取提取液1 mL，經(jīng)0.22 μm尼龍系微孔濾膜后，轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于10 mL容量瓶中，色譜級甲醇溶解定容。經(jīng)0.22 μm尼龍微孔濾膜過濾，配制成1 mg·mL-1溶液作為混合對照溶液。在相同的測試條件下，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為基準(zhǔn)，計(jì)算臺蘑目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

3） 色譜條件

色譜柱為AQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流動(dòng)相A為乙腈溶液，流動(dòng)相B為 0.05%甲酸水溶液；流速 0.3 mL·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量 5 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% 流動(dòng)相A；0.5 min～5 min，30% 流動(dòng)相A；5 min～11 min，90%流動(dòng)相 A；11 min～14 min，10%流動(dòng)相A。

4） 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式，負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓2.90 kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度400℃，錐孔氣N2流速50 L·h-1，脫溶劑氣（N2）流速600 L·h-1，碰撞氣（Ar）流速0.07 mL·min-1。

1.3.3 臺蘑多酚的抗氧化活性測定

1）DPPH自由基清除率測定

參照 Gasecka 等[11]方法，略作改動(dòng)。200 μmol·L-1DPPH溶液配制：準(zhǔn)確量取0.1 mg·mL-1DPPH溶液48 mL，用甲醇定容在100 mL容量瓶中，4℃避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。2 mL待測液及2 mL DPPH溶液加入試管中，搖勻，避光放置30 min。以甲醇為參比，于517 nm測定其吸光度值。DPPH自由基的清除率（C1，%） 的計(jì)算公式為：

式中：A0為2 mL溶劑、2 mL DPPH混合溶液的吸光度值；Ai為2 mL待測液、2 mL DPPH混合溶液的吸光度值；Aj為2 mL待測液、2 mL甲醇溶劑的吸光度值。

2）羥基自由基清除率測定

參考李白存等[12]方法，略作改動(dòng)。在試管中加入1.0 mL濃度為6.0 mmol Fe2+和1.0 mL 6 mmol水楊酸-乙醇溶液，分別加1.0 mL濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、 0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1的待測液，加5 mL蒸餾水，再分別加入1 mL 6.0 mmol H2O2?；靹蚝箪o置10 min，在波長為510 nm處測定吸光度。羥基自由基清除率（C2，%） 的計(jì)算公式為：

式中:B0為以蒸餾水作空白液時(shí)的吸光度值；Bi為加入樣品后的吸光度值。

3）總抗氧化能力測定

選用南京建成生物工程研究所的總抗氧化能力試劑盒進(jìn)行測定，總抗氧化能力（C3，U·mL-1）的計(jì)算公式為：

式中:Ci為樣品吸光度值；C0為空白吸光度值；V1為反應(yīng)液總體積（mL）；V2為取樣量（mL）；A為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 3種臺蘑的總酚及總黃酮含量比較

3種臺蘑中的總酚和總黃酮含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 臺蘑總酚及總黃酮含量Tab.1 Contents of total phenols and total flavonoids in Taimo

如表1所示，3種臺蘑的總酚、總黃酮含量具有顯著性差異（P＜0.05）。其中五臺杯傘的總酚和總黃酮含量最高，其總酚含量（4.83±0.03） mg·g-1是香杯傘、紫丁香蘑的1.38和1.20倍，總黃酮含量（3.69±0.06） mg·g-1是香杯傘、紫丁香蘑的2.5和1.06倍。

不同食用菌其總酚、總黃酮含量因其地理環(huán)境、栽培條件、預(yù)處理方式、提取方式等因素不同而存在差異。Palacios等[13]測定了西班牙不同地區(qū)8種食用菌總酚含量為 1 mg·g-1～6 mg·g-1,總黃酮含量為0.9 mg·g-1～3.0 mg·g-1，其中野生牛肝菌 （Boletus sp.）總酚和總黃酮含量分別為5 mg·g-1、2.2 mg·g-1,與本研究中野生臺蘑略有差異。Bach等[14]對巴西多種食用菌研究發(fā)現(xiàn)，采用75%乙醇提取雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）和姬松茸（Agaricus blazei）中的總酚時(shí)其總酚含量最高，分別為9.97 mg·g-1和13.16 mg·g-1，金針菇 （Flammulina velutipes） 和香菇的最優(yōu)提取條件則是使用25%乙醇，其總酚含量為 8.38 mg·g-1和 5.66 mg·g-1。繆錢江等[15]測定 4 種食用菌總黃酮含量，得到榆黃菇（Pleurotus citrinopileatus）、秀珍菇 （Pleurotus geesteranus）、黑木耳 （Auricularia auricula）、平菇 （Pleurotus ostreatus）的總黃酮含量分別為1.33 mg·g-1、0.87 mg·g-1、0.64 mg·g-1、3.16 mg·g-1。

2.2 臺蘑多酚的UPLC-MS/MS分析

酚類化合物是食用菌中具有較高活性的次生代謝產(chǎn)物，依照其所含芳香酚環(huán)的數(shù)量和這些環(huán)的不同官能團(tuán)，主要分為酚酸類、類黃酮類、單寧類等，具有顯著的結(jié)構(gòu)多樣性[16]。為進(jìn)一步明確臺蘑醇提物的酚類物質(zhì)組成，采用UPLC-MS/MS對提取液進(jìn)行分析，采用多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring,MRM）方式對樣品定性定量分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的母離子、子離子檢測離子對及保留時(shí)間比對定性，采用外標(biāo)法建立回歸方程進(jìn)行酚類物質(zhì)定量分析。不同樣品MRM色譜圖見1，酚類物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

圖1 不同樣品的MRM色譜圖Fig.1 MRM chroma tograms of different samples

表2 酚類物質(zhì)質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.2 Tandem mass spectrometric parameters for phenolic compositions

以對照品的峰面積（y） 和相應(yīng)濃度（x） 進(jìn)行線性回歸得到的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)，見表3。

表3 酚類物質(zhì)線性方程Tab.3 Linear equations of phenolic compositions

通過統(tǒng)計(jì)計(jì)算，分析臺蘑醇提物中酚類物質(zhì)，結(jié)果見表4。

表4 臺蘑酚類物質(zhì)的定性和定量分析Tab.4 Qualitative and quantitative analysis of phenolic compositions in Taimo

由表4可知，3種臺蘑酚類化合物組成相似，主要包括對羥基苯甲酸、肉桂酸、沒食子酸、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸等，其中對羥基苯甲酸、肉桂酸含量顯著高于其他酚類物質(zhì)。但不同臺蘑中酚類化合物含量存在差異，紫丁香蘑中對香豆酸（4.69±0.32） μg·g-1、肉桂酸 （29.34 ± 2.11） μg·g-1含量顯著高于其他2種臺蘑，香杯傘中對羥基苯甲酸含量（21.36±1.15） μg·g-1最高，五臺杯傘中沒食子酸（3.22±0.03） μg·g-1、原兒茶酸 （3.82±0.20） μg·g-1、槲皮素 （4.44±0.38） μg·g-1含量較高。Alkan等[17]研究發(fā)現(xiàn)肉桂酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、原兒茶酸和沒食子酸是食用菌中最常見的酚酸。采用HPLC-DAD對土耳其18種食用菌進(jìn)行酚類物質(zhì)含量測定，Cayan等[18]比較發(fā)現(xiàn)了紅菇（Russula aurora） 中沒食子酸 （2.96±0.56） μg·g-1、原兒茶酸（4.89±0.32） μg·g-1含量高于其他食用菌；然而在牛肝菌（Suillus granulatus） 中含量很高的兒茶素（16.59±0.71） μg·g-1，在 3種臺蘑中均未測出；對羥基苯甲酸在露背菇 [Lepista nuda(Bull.)cook]中含量最高，為（5.44±0.67） μg·g-1，同樣發(fā)現(xiàn)在3種臺蘑中對羥基苯甲酸的含量顯著高于其他物質(zhì)。另有研究表明，對羥基苯甲酸在巴西雙孢蘑菇和姬松茸中含量較高，分別達(dá)到（57.12±1.20） μg·g-1，（332.76±2.98） μg·g-1[18]。

2.3 臺蘑多酚的抗氧化能力分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的檢測，是一種廣泛應(yīng)用于評估自由基清除劑或氫供體抗氧化能力的方法[19]。3種臺蘑不同多酚濃度對DPPH自由基的清除能力見圖2。

圖2 臺蘑多酚對DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity of the polyphenols of Taimo onDPPHradical

如圖2所示，3種臺蘑多酚對DPPH自由基清除能力均與濃度呈正相關(guān)，但3種臺蘑多酚對DPPH自由基的清除能力有明顯不同。多酚DPPH自由基清除能力的大小順序?yàn)椋何迮_杯傘＞紫丁香蘑＞香杯傘。在多酚濃度為 0.1 mg·mL-1～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，五臺杯傘多酚的清除能力顯著高于香杯傘與紫丁香蘑；多酚濃度為3.0 mg·mL-1時(shí)，五臺杯傘、紫丁香蘑、香杯傘多酚的DPPH自由基清除率分別達(dá)到91.66%，87.50%和83.80%。經(jīng)過分析顯示，香杯傘、五臺杯傘、紫丁香蘑IC50值分別為1.76 mg·mL-1、1.12 mg·mL-1、1.39 mg·mL-1。

2.3.2 羥基自由基清除率

羥基自由基作為一種得電子極強(qiáng)的活性氧，可通過氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和核酸等物質(zhì)直接損傷各種生物膜，對生物機(jī)體危害極大[20]，食用菌富含的多酚類化合物對其具有較強(qiáng)的清除能力。3種臺蘑不同濃度多酚對羥基自由基清除能力見圖3。

圖3 臺蘑多酚對羥基自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of the polyphenols of Taimo on hydroxyl radical

如圖3所示，多酚羥基自由基清除能力的大小順序?yàn)椋何迮_杯傘＞紫丁香蘑＞香杯傘。在多酚濃度為 0.1 mg·mL-1～1.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，隨著多酚濃度的增大，羥基自由基清除率也隨之提高；在多酚濃度為 1.0 mg·mL-1～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，羥基自由基清除率逐漸趨于平緩，并達(dá)到最大清除率；多酚濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，3種臺蘑多酚的羥基自由基清除率均達(dá)到100%。香杯傘、五臺杯傘、紫丁香蘑IC50值分別為 0.47 mg·mL-1、0.35 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1。

2.3.3 總抗氧化能力

食用菌中多酚類抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固絡(luò)合物，通過比色可測定出其抗氧化能力高低。采用T-AOC法測得3種臺蘑不同多酚濃度的總抗氧化能力見圖4。

如圖4所示，3種臺蘑多酚的總抗氧化能力均與其濃度呈正相關(guān)，且在相同濃度下五臺杯傘的總抗氧化能力顯著高于其他2種臺蘑。多酚的總抗氧化能力大小順序?yàn)椋何迮_杯傘＞紫丁香蘑＞香杯傘。當(dāng)多酚濃度達(dá)3 mg·mL-1時(shí)，香杯傘、五臺杯傘、紫丁香蘑的總抗氧化能力分別為9.790 U·mL-1，18.655 U·mL-1，14.130 U·mL-1。

圖4 臺蘑多酚的總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of Taimo polyphenols

2.4 臺蘑活性成分與其抗氧化活性的相關(guān)性分析

多酚類化合物是一種有效的天然抗氧化劑，通過不同的抗氧化機(jī)制發(fā)揮作用。已有研究表明，食用菌多酚化合物可作為電子供體，中和自由基或與金屬離子螯合，抑制氧自由基的產(chǎn)生，通過阻止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及脂質(zhì)過氧化，從而避免機(jī)體氧化損傷；此外，多酚類化合物還可通過酶抑制作用發(fā)揮抗氧化活性[21]。且目前也有研究表明，食用菌酚類物質(zhì)的定量和定性特征可影響其抗氧化能力[22]?；谏鲜龆喾踊衔锝M成的分析，選定3種臺蘑多酚化合物中的幾種含量相對較高的主要酚類成分與抗氧化指標(biāo)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，以期發(fā)現(xiàn)臺蘑多酚抗氧化活性與組成之間的關(guān)系。3種臺蘑活性成分與其抗氧化活性的相關(guān)性分析見表5。

如表5所示，酚酸類物質(zhì)中沒食子酸、原兒茶酸與DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、總抗氧化能力均具有顯著相關(guān)性。Sezgin等[6]通過對土耳其5種食用菌醇提物抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸、沒食子酸、原兒茶酸是其發(fā)揮高抗氧化活性的主要酚酸組成，與本研究結(jié)果相似。對羥基苯甲酸、肉桂酸與DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力呈負(fù)相關(guān)性，分析二者與臺蘑多酚發(fā)揮抗氧化活性無較大關(guān)聯(lián)。黃酮類物質(zhì)中槲皮素與DPPH自由基清除能力呈顯著正相關(guān)（r=0.831），蘆丁與各抗氧化指標(biāo)間相關(guān)性不高，說明槲皮素相對于蘆丁，在臺蘑多酚抗氧化活性中貢獻(xiàn)更高。Seer－am等[23]研究發(fā)現(xiàn)C環(huán)所連接的糖苷糖單位數(shù)越多相應(yīng)的抗氧化能力越弱，據(jù)此可推測槲皮素抗氧化活性高于蘆丁，與本研究中分析結(jié)果一致。袁博等[24]通過綜合評價(jià)咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，槲皮素的抗氧化活性優(yōu)于蘆丁，進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)結(jié)果。由以上分析可看出，多酚的羥基數(shù)目和位置對其抗氧化活性具有很大影響，由于本研究中存在其他未知酚類物質(zhì)未檢出，無法斷定酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性相關(guān)性以及是否存在酚類物質(zhì)間的協(xié)同效應(yīng)，還需后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

表5 臺蘑活性成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of the content of active components and antioxidant activity of Wutai edible fungis

3 結(jié)論

食用菌的多酚類物質(zhì)種類多樣，且具有多種生理活性。研究結(jié)果表明，香杯傘、五臺杯傘、紫丁香蘑3種野生臺蘑均富含酚類化合物，其中五臺杯傘總酚和總黃酮含量最高；進(jìn)一步采用UPLC-MS/MS法對3種臺蘑多酚類物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，鑒定出臺蘑多酚中含有8種酚酸類和2種黃酮類物質(zhì)，其中對羥基苯甲酸、肉桂酸、沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素、蘆丁含量較高。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，五臺杯傘抗氧化活性高于香杯傘和紫丁香蘑，經(jīng)皮爾遜相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素與臺蘑多酚抗氧化活性具有顯著正相關(guān)性。對3種臺蘑中10種多酚類化合物種類和含量的闡述，可為臺蘑的加工利用提供一定參考。