王藝琴，郭 豪，張素勤，耿廣東

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

木耳（Auricularia spp.）屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 木耳目 （Auriculariales） 木耳科（Auriculariaceae），是一類重要的木腐菌，為森林生態(tài)系統(tǒng)中的降解還原發(fā)揮重要作用[1]。木耳屬真菌具有較高的營(yíng)養(yǎng)、藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是世界上栽培最多的食用菌種類之一，具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂、降膽固醇等作用[2-6]。木耳子實(shí)體富含大量多糖、蛋白質(zhì)和膠質(zhì)物，嚴(yán)重干擾了其基因組DNA（gDNA）的提取。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法和十二烷基硫酸鈉（SDS） 法作為DNA提取的常用方法，常需根據(jù)生物特性的不同進(jìn)行改進(jìn)。由于多糖可儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)且是組成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)，是在分離許多植物物種的DNA時(shí)最常遇到的問(wèn)題之一[7]，已經(jīng)成為植物DNA提取過(guò)程中的主要干擾成分[8]。多糖與DNA的理化性質(zhì)很相似[9]，在操作過(guò)程中會(huì)與DNA相互結(jié)合形成粘稠膠狀物，從而難以提取DNA。有些酶還可能會(huì)因活性中心或必需基團(tuán)被這種多糖膠狀物所改變而遭到活性抑制，嚴(yán)重影響后期分子生物學(xué)方面的研究工作。

已有研究表明，不同的DNA提取方法適用的真菌種類差異較大[10]。楊華和李聯(lián)泰[11]對(duì)食用菌菌絲DNA提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，但由于木耳子實(shí)體及菌絲中含有大量的多糖，采用常規(guī)CTAB法、SDS法提取gDNA時(shí)，提取出的DNA帶有棕褐色膠凍狀多糖物質(zhì)，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)DNA拖尾、加樣孔明亮，且有嚴(yán)重的蛋白、多糖和多酚污染，后續(xù)試驗(yàn)難以開(kāi)展。已有研究報(bào)道，真菌的gDNA提取試劑盒雖可有效提取真菌gDNA，但DNA產(chǎn)率低，且存在明顯降解問(wèn)題，不能滿足后續(xù)試驗(yàn)需求[11]。

因此，通過(guò)采用4種方法從脆木耳（Auricularia fibrillifera）新鮮子實(shí)體中提取gDNA，探索能提取高質(zhì)量gDNA的方法，為木耳gDNA的提取、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、分子輔助育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

脆木耳菌株，源自貴州大學(xué)園藝科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。脆木耳栽培袋制作參考張曉宇等[12]的方法；栽培料配方：木屑78%、麩皮20%、石膏1%、石灰1%。

CTAB 提取液：3%CTAB、100 mmol·L-1Tris-HCl、25 mmol·L-1EDTA、1.5 mol·L-1NaCl。CTAB-free 緩沖液：200 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1EDTA、250 mmol·L-1NaCl，使用前加入 1%的 β-巰基乙醇。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

栽培種于貴州大學(xué)園藝科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，溫度（25±1）℃；當(dāng)子實(shí)體直徑達(dá)到2 cm～3 cm時(shí)，選取10個(gè)長(zhǎng)勢(shì)一致的子實(shí)體，切塊后混勻，用于提取DNA。取0.1 g子實(shí)體混樣，于液氮中用研缽磨成粉末，分別采用改良CTAB法、CTAB-free法、試劑盒法和試劑盒聯(lián)合CTAB-free法提取gDNA，每種方法設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 脆木耳子實(shí)體gDNA提取方法的篩選

1.3.1 改良CTAB法

參考劉麗等[13]提取齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）的改良CTAB法。將子實(shí)體混樣粉末、65℃預(yù)熱的1 mL CTAB提取液（CTAB提取液預(yù)熱后加入1%的β-巰基乙醇） 和60 μL β-巰基乙醇一起置于2 mL離心管中，劇烈振蕩至樣品與提取混合液充分混合均勻。離心管于65℃水浴45 min，在此期間上下反復(fù)顛倒2～3次，重懸，之后加入無(wú)水乙醇（0.25倍體積） 和5 mol·L-1醋酸鉀（0.11倍體積），混勻后冰浴1 h。放置至室溫后，再加入600 μL的混合液A（氯仿和異戊醇的體積比為24∶1），混勻后12 000 r·min-1、4℃離心 10 min。取上清液加入 5 mol·L-1NaCl至終濃度為 0.7 mol·L-1，530 μL CTAB/NaCl（10%CTAB、0.7 mol·L-1NaCl），混合均勻后65℃水浴30 min。待樣品冷卻至室溫后再加入等體積的混合液A，反復(fù)顛倒數(shù)次直至液體出現(xiàn)分層，靜置后小心吸取上層液體于新離心管中，加入等體積的混合液B（苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25∶24∶1），混勻后吸取上清液。在上清液中加入2.5倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇及10%的3 mol·L-1NaAC或KAC，輕柔顛倒混勻后-20℃條件下沉淀1 h。4℃條件下12 000 r·min-1離心10 min，小心棄去上清液，用70%乙醇漂洗2次沉淀，小心棄去上清液后真空干燥。用100 μL ddH2O或TE緩沖液溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CTAB-free法

CTAB-free法參考王經(jīng)源等[14]提取高多糖植物DNA的方法。將樣品粉末移入2 mL離心管，加入600 μL CTAB-free緩沖液，振蕩混合均勻后將離心管置于冰上10 min。4℃條件下8 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清液。加入300 μL CTAB提取液（65℃預(yù)熱），震蕩均勻后65℃水浴30 min。再與300 μL氯仿輕顛混合均勻，5 min后5 000 r·min-1離心5 min。重新轉(zhuǎn)移上層水相移至新的2 mL離心管中，混合2倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒后靜置5 min。將乙醇沉淀絮狀DNA小心轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇，輕柔洗滌沉淀，小心棄去上清液，重復(fù)操作一次。沉淀經(jīng)空氣干燥20 min后溶于100 μL TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 試劑盒法

真菌gDNA提取試劑盒DP2031購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。使用試劑盒進(jìn)行提取，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.4 試劑盒聯(lián)合CTAB-free法

在樣品粉末中加入1.2 mL CTAB-free緩沖液，反復(fù)振蕩混合均勻后冰浴10 min。4℃條件下6 000 r·min-1離心5 min。小心棄去上清液，沉淀使用真菌gDNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

1.4 脆木耳子實(shí)體gDNA質(zhì)量檢測(cè)

使用生物光度計(jì)（Eppendorf）測(cè)定樣品濃度和吸光度值，并計(jì)算OD260/OD280的比值。當(dāng)OD260/OD280比值為1.70～1.90，說(shuō)明DNA純度較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)；OD260/OD280比值小于1.70，說(shuō)明樣品中有蛋白質(zhì)和酚類等雜質(zhì)；OD260/OD280比值大于1.90，說(shuō)明樣品有RNA殘留。

使用1%質(zhì)量濃度的瓊脂糖凝膠；取5 μL DNA樣品混勻，加入1 μL上樣緩沖液，混合后點(diǎn)樣；進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，110 V電泳30 min；采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.5 PCR驗(yàn)證

根據(jù)Jia等[15]對(duì)玉木耳（Auricularia cornea） 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）定量引物篩選的結(jié)果，選擇多聚泛素基因（Polyubiquitin，UBQ） 作為內(nèi)參基因。使用內(nèi)參基因UBQ引物，對(duì)4種方法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)參基因UBQ引物Tab.1 The primers of reference gene UBQ

PCR的反應(yīng)體系為20 μL，包含：25 ng DNA，2.4 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），2.0 μL Taq酶緩沖液（10 ×Taq Buffer），0.2 μL Taq 酶 （500 U），ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃初始變性5 min；94℃變性 30 s，60℃退火 40 s，72℃延伸 30 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2010和SPSS 24.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的gDNA濃度及純度分析

4種方法提取脆木耳子實(shí)體gDNA的濃度及含量分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品DNA提取濃度及純度統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistical table of DNA extraction concentration and purity of samples

由表2可知，改良CTAB法、CTAB-free法、試劑盒法、試劑盒聯(lián)合CTAB-free法均能提取出脆木耳子實(shí)體中的gDNA。試劑盒聯(lián)合CTAB-free法提取的gDNA吸光度OD260/OD280比值在1.7～1.9，DNA質(zhì)量好，且無(wú)蛋白和RNA殘留，純度最高。試劑盒法也可提取出較高濃度的gDNA，但OD260/OD280比值大于2.0，純度較低。CTAB-free法提取的gDNA濃度和純度均較低，且有明顯的蛋白污染。改良CTAB法提取過(guò)程中，出現(xiàn)了大量的粘稠膠狀物而非澄清的上清液，且抽提后仍有色素殘留；提取的DNA濃度最低，且OD260/OD280比值在1.3～1.5，DNA純度最低。

對(duì)采用4種方法提取的木耳子實(shí)體gDNA的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同方法提取木耳子實(shí)體gDNA的方差分析Tab.3 Analysis of variance of gDNA extracted from Auricularia fibrillifera fruit body by different methods

由表3可知，不同方法對(duì)脆木耳子實(shí)體gDNA的提取結(jié)果達(dá)到了極顯著差異（P＜0.01）。因此，試劑盒聯(lián)合CTAB-free法提取的DNA質(zhì)量好，純度高，是脆木耳子實(shí)體gDNA提取的理想方法。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

對(duì)4種方法提取的木耳子實(shí)體gDNA進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection

如圖1所示，試劑盒聯(lián)合CTAB-free法提取的DNA電泳條帶明亮，主帶清晰且無(wú)拖帶現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔干凈，證明該方法提取的DNA濃度較高、質(zhì)量較好，能夠有效去除RNA、蛋白質(zhì)、多糖和酚類等雜質(zhì)殘留。試劑盒法提取的DNA電泳條帶比試劑盒聯(lián)合CTAB-free法提取的DNA條帶亮度低，主帶明顯但有拖尾現(xiàn)象，質(zhì)量較差。CTAB-free法提取的DNA條帶拖尾嚴(yán)重，加樣孔有亮帶，表明提取的DNA中還含有大量的多糖。試劑盒提取的DNA條帶較為清晰，但較CTAB-free法提取的DNA濃度低，所以電泳結(jié)果條帶較暗。采用CTAB-free處理過(guò)的樣品再用真菌通用DNA提取試劑盒提取后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA條帶清晰，其提取率和純度均更高，無(wú)拖帶現(xiàn)象和RNA等雜質(zhì)污染。

2.3 PCR驗(yàn)證結(jié)果

使用UBQ引物對(duì)4種提取方法提取的gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)條帶124 bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 UBQ引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of UBQ primers

如圖2所示，改良CTAB法和CTAB-free法提取的gDNA未擴(kuò)增出目的條帶，改良CTAB法提取的gDNA還存在非特異性擴(kuò)增條帶。試劑盒聯(lián)合CTAB-free法提取的gDNA擴(kuò)增出清晰條帶，說(shuō)明該方法提取的gDNA可以適用于后續(xù)分子研究。

3 討論

在提取gDNA過(guò)程中，DNA提取的質(zhì)量受到多個(gè)因素影響。很難通過(guò)傳統(tǒng)的CTAB法或單一的處理從多糖含量較高的組織中提取出高質(zhì)量的gDNA，大量的粘稠性多糖會(huì)包裹DNA共沉淀共溶解，從而影響DNA和其他蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的分離，嚴(yán)重影響后續(xù)試驗(yàn)。因此，有效去除多糖、減少DNA的損失已是提取DNA的關(guān)鍵。由于多糖不溶于乙醇，所以當(dāng)乙醇溶液加入含有多糖的提取液中時(shí)，多糖分子就會(huì)被分離；再利用高鹽高濃度乙醇溶解多糖、沉淀DNA，則可得到質(zhì)量較高的DNA[16]。潘英文等[17]利用改良CTAB法和試劑盒法提取富含多糖、多酚物質(zhì)的蘭科植物，得出CTAB法獲得的DNA濃度高于試劑盒法，且后續(xù)PCR擴(kuò)增效果也優(yōu)于試劑盒法。劉麗等[13]使用高濃度的醋酸鉀和無(wú)水乙醇初步沉淀多糖，再用CTAB/NaCl溶液再次去除多糖，提取出濃度、純度都較高的齊整小核菌gDNA。張景榮等[18]利用硅膠膜離心柱與自配的溶液提取了高質(zhì)量的黃秋葵DNA，并發(fā)現(xiàn)試劑盒聯(lián)合CTAB-free法可提取蘆薈、石斛、葡萄、無(wú)花果等多種富含多糖、多酚以及其他大量次生代謝物的植物gDNA。王志會(huì)等[19]使用天根生化科技（北京）有限公司的gDNA提取試劑盒提取了醬香型白酒中13個(gè)細(xì)菌菌株的DNA。CTAB法、試劑盒法及氯化芐法被報(bào)道為絲狀真菌gDNA的主要提取方法[20]。絲狀真菌含有細(xì)胞壁，破碎細(xì)胞壁后可增加絲狀真菌gDNA的提取效率，目前石英砂研磨法和液氮研磨法是破碎真菌細(xì)胞壁的主流方法。一種黑曲霉屬絲狀真菌菌絲富含大量多糖、多酚及色素等，菌絲經(jīng)液氮研磨后，采用CTAB法提取并結(jié)合試劑盒純化可以有效提取黑曲霉（Aspergillus niger）gDNA[21]。譙利軍等[22]利用真菌 gDNA提取試劑盒從紅菇子實(shí)體中提取出了DNA。

在前人對(duì)木耳屬真菌的研究中，多數(shù)以菌絲體或干樣為材料提取DNA，從子實(shí)體中提取DNA的報(bào)道較為少見(jiàn)[23-28]。木耳子實(shí)體和菌絲體中多糖、酚類及色素含量較多，在提取DNA時(shí)，這些物質(zhì)形成的粘稠膠狀物會(huì)裹挾DNA而導(dǎo)致DNA損失，且這種帶有雜質(zhì)的DNA又會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)PCR擴(kuò)增的效果和穩(wěn)定性。通過(guò)在使用試劑盒提取前加入CTAB-free緩沖液，可以去除大部分的粘稠膠狀物，大大減少木耳子實(shí)體和菌絲體中的多糖、酚類等物質(zhì)，可明顯提高DNA的純度和質(zhì)量。