薛科宇，田繼鋒，宋國(guó)華，魏 珂，金子純，趙婕妤，侯曉慧

（許昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心許昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000）

食用菌營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分和多糖類(lèi)、核苷類(lèi)等功能性成分，是集“天然、營(yíng)養(yǎng)、保健”為一體的綠色食品，是人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。同時(shí)，因栽培成本低、投資小、市場(chǎng)好的特點(diǎn)，近幾年食用菌產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展。2020年全國(guó)食用菌總產(chǎn)量達(dá)4 043.87萬(wàn)噸，總產(chǎn)值達(dá)3 127億元。在我國(guó)部分地區(qū)，食用菌產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)和脫貧產(chǎn)業(yè)，極大地促進(jìn)了農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展，增加了農(nóng)民收入[1-2]。

在食用菌栽培過(guò)程中，為有效抵制其競(jìng)爭(zhēng)性雜菌、防治病蟲(chóng)害、提高出菇產(chǎn)量及品質(zhì)，會(huì)使用一定量的農(nóng)藥。農(nóng)藥的大量使用，雖然有效地防止了病蟲(chóng)害，提高了經(jīng)濟(jì)效益，但也給人類(lèi)的身體健康以及生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。并且，食用菌的基質(zhì)來(lái)源比蔬菜復(fù)雜，因此建立快速、高效、靈敏的食用菌多農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)具有十分重要的意義。

目前，農(nóng)藥殘留的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等；樣品前處理技術(shù)主要有固相萃取法、凝膠滲透色譜法、加速溶劑萃取法等[3-7]。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe） 是一種新穎、快速的分散固相萃取技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠、安全的特點(diǎn)，很多研究都是以該方法為基礎(chǔ)開(kāi)展的。碳納米管因其獨(dú)特的微觀結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的吸附能力，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)?；谔技{米管的固相萃取技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好等方面的特點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中[8-12]。

通過(guò)利用多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNTs） 的吸附性能，結(jié)合QuEChERS法，樣品經(jīng)乙腈提取，液相色譜-質(zhì)譜分析檢測(cè)，建立一種高效、快速、準(zhǔn)確分析食用菌中多種農(nóng)藥殘留的分析方法。結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單、分析準(zhǔn)確高效，適用于食用菌的日常檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；QuEChERS提取鹽包（檸檬酸緩沖液體系鹽包，4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉），北京綠棉科技有限公司；QuEChERS凈化離心管（900 mg硫酸鎂），采購(gòu)自上海安譜科技有限公司；多壁碳納米管（外徑20 nm～30 nm，長(zhǎng)度 0.5 μm～ 2.0 μm，純度＞95%），南京先鋒納米材料科技有限公司；乙腈、甲醇、丙酮（色譜純），美國(guó)Fisher scientific公司；乙酸（分析純），美國(guó)Fisher Scientific公司；乙酸銨（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)用水為超純水。

供試食用菌品種包括金針菇（Flammulina velutipes）、香菇 （Lentinus edodes）、平菇 （Pleurotus ostreatus）、蟹味菇 （Hypsizygus marmoreus），均購(gòu)自許昌市當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

HS20500D型超聲波清洗器，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；ZG-YM1701型破壁機(jī)，寧波趙記電器有限公司；0.22 μm微孔濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TTL-DCII型氮吹儀，北京同泰科技發(fā)展有限公司；EVOQ LC-TQ液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國(guó)布魯克公司；ULPHW-IV超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司；BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

分別準(zhǔn)確移取每種標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1）0.8 mL于5 mL容量瓶中，用丙酮稀釋定容，配制成160.00 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中，-20℃保存。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的食用菌樣品10.00 g于離心管中，加10.00 mL乙腈，加入提取試劑包，迅速振蕩1 min；放入離心機(jī)以4 200 r·min-1離心5 min，取上清液6 mL于凈化管中；震蕩1 min后4 200 r·min-1離心5 min，取上清液4 mL于加有凈化劑的15 mL離心管中；40℃水浴氮吹近干，加入4 mL丙酮后超聲30 s；經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后放入進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acclaim TM RSLC 120 C18（柱長(zhǎng)100 mm，直徑2.1 mm，粒徑2.2 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A：水（10 mmol·L-1乙酸銨+0.01%乙酸）；流動(dòng)相B：甲醇（10 mmol·L-1乙酸銨+0.01%乙酸）；梯度洗脫程序：0～3 min，11.0%～39.9%流動(dòng)相B，流速 0.20 mL·min-1；3 min～14 min，39.9%～99.9%流動(dòng)相 B，流速 0.40 mL·min-1；14 min～16 min，99.9%流動(dòng)相 B，流速 0.40 mL·min-1～ 0.48 mL·min-1；16 min～20 min，99.9%流動(dòng)相 B，流速 0.48 mL·min-1；20.1 min～23.0 min，沖洗，流動(dòng)相B由99.9%逐漸減少至 1.0%，流速 0.48 mL·min-1；進(jìn)樣體積 5 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離源模式：正離子模式。

掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源電壓3 500 V，霧化器電壓40 V；干燥氣流速20 L·min-1，干燥氣溫度350℃；鞘氣電壓40 V，鞘氣溫度400℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

理想的液相色譜流動(dòng)相中有機(jī)相應(yīng)具有粘度低、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。大部分液相分析試驗(yàn)的流動(dòng)相中有機(jī)相多選擇甲醇或乙腈[13]，因此設(shè)計(jì)分別以甲醇和乙腈作為有機(jī)相的試驗(yàn)。同時(shí)，在液相色譜-質(zhì)譜分析過(guò)程中，信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)因?yàn)殡x子強(qiáng)度的變化而改變。在流動(dòng)相中添加緩沖鹽，可有效地穩(wěn)定體系，并提高信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度。參照參考文獻(xiàn)[14-16]，試驗(yàn)常用的添加劑為揮發(fā)性有機(jī)酸和低濃度的鹽，揮發(fā)酸濃度不超過(guò)0.1%，鹽濃度小于10 mmol·L-1[13]。因此設(shè)計(jì)分別以水-甲醇（均含有10 mmol·L-1乙酸銨）、水-乙腈（均含有10 mmol·L-1乙酸銨）作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)常見(jiàn)農(nóng)藥混標(biāo)溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，在2種流動(dòng)相中，常用農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均有響應(yīng)；但在甲醇流動(dòng)相中，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)高于乙腈流動(dòng)相。同時(shí)，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)部分農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的峰型并不理想，少數(shù)出現(xiàn)前拖現(xiàn)象。為了優(yōu)化峰型，在流動(dòng)相中加入低濃度的乙酸（含量0.01%）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 目標(biāo)化合物色譜圖Fig.1 Chromatogram of target compound

如圖1所示，流動(dòng)相中加入低濃度的乙酸（含量0.01%） 使其峰型得到優(yōu)化，圖1中目標(biāo)化合物的濃度為0.10 mg·L-1。因此，選取水-甲醇（均含有10 mmol·L-1乙酸銨和0.01%乙酸） 作為色譜分析的流動(dòng)相。

2.2 定性分析

用選定的流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。在正離子掃描下，調(diào)整碰撞電壓，確定目標(biāo)化合物的定性離子對(duì)和定量離子對(duì)。各目標(biāo)化合物峰型完整，各離子對(duì)符合定性分析要求[17]，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)化合物保留時(shí)間及質(zhì)譜信息Tab.1 Retention time and MS Spectrometer results of target compound

2.3 線性關(guān)系與檢出限

將農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 ug·mL-1～0.40 ug·mL-1），在選定條件下進(jìn)行測(cè)定，以樣品中各種目標(biāo)化合物峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（ug·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在0.01 ug·mL-1～0.40 ug·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，定量限為0.01 ug·mL-1，可以滿(mǎn)足定量分析要求。

2.4 多壁碳納米管的選擇

為了能夠選擇到比較合適的碳納米管，選擇未檢出農(nóng)藥殘留、基質(zhì)干凈的平菇空白樣品，添加已知濃度（本次試驗(yàn)濃度為0.10 mg·kg-1）農(nóng)藥目標(biāo)化合物，按照前處理方法進(jìn)行試驗(yàn)。以碳納米管作為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)置5 mg、25 mg、50 mg的用量進(jìn)行試驗(yàn)。前處理后經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)計(jì)算獲得各目標(biāo)物加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 碳納米管不同用量的目標(biāo)物回收率Fig.2 Recovery of target compounds with different amounts of carbon nanotubes

由圖2可知，目標(biāo)化合物的回收率與用量不呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。通常情況下，多農(nóng)殘分析方法中各目標(biāo)物的平均回收率應(yīng)滿(mǎn)足的范圍是70%～120%，試驗(yàn)結(jié)果顯示個(gè)別目標(biāo)物的回收率不能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，如乙酰甲胺磷、多菌靈、敵敵畏、亞胺硫磷、特丁硫磷、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、嘧霉胺、除蟲(chóng)脲、治螟磷、咪鮮胺等化合物。這可能是因?yàn)樘技{米管的用量大，吸附效果增強(qiáng)，造成某些農(nóng)藥目標(biāo)化合物的吸附，從而回收率降低。綜合以上因素，選擇5 mg的碳納米管用量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在粉碎后的金針菇、香菇、平菇空白樣品（未檢出農(nóng)藥殘留、樣品基質(zhì)干凈） 中分別加入0.03 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次。按照樣品前處理方法，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，得到目標(biāo)化合物的回收率范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)化合物添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Tab.2 Spike recoveries and RSDs of target compounds(n=5)

如表2所示，目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合檢測(cè)要求[18-19]。

2.6 樣品的測(cè)定

對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的蟹味菇按照前處理方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果未檢出有農(nóng)藥殘留物。

3 結(jié)論

食用菌中含有色素、蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)干擾目標(biāo)化合物的響應(yīng)。通過(guò)參考QuEChERS前處理技術(shù)，并對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，用碳納米管代替?zhèn)鹘y(tǒng)QuEChERS方法中的PSA（乙二胺-N-丙基硅烷），利用碳納米管的強(qiáng)吸附性，提升凈化效果。對(duì)檢測(cè)條件、前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，常見(jiàn)的農(nóng)藥殘留在香菇、平菇、金針菇等食用菌樣品中均得到了較好的回收率，滿(mǎn)足定性分析、定量分析的檢測(cè)要求。本方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、可行性強(qiáng)，能夠快速檢測(cè)食用菌中常見(jiàn)農(nóng)藥殘留，可為食用菌中常用農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)提供技術(shù)支持。