辛世紀(jì)，劉靜雯，班立桐，黃 亮，王 玉，孫 寧

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

靈芝（Ganoderma lucidum），屬多孔菌科（Polyporaceae） 靈芝屬（Ganoderma），是常見的藥用真菌。研究表明，靈芝多糖的原料來源主要有人工栽培和液態(tài)發(fā)酵2種，其中人工栽培仍是目前靈芝多糖提取原料的主要來源[1]。靈芝液體發(fā)酵可以獲得靈芝的主要活性成分，同時(shí)液體發(fā)酵技術(shù)具有周期短、易操作、成本低、效益高等優(yōu)點(diǎn)，且能夠大大提高靈芝活性成分的產(chǎn)量[2]，得到了國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注[3-4]，對(duì)于靈芝工廠化生產(chǎn)更為有利。

靈芝多糖是靈芝最主要的活性成分之一，是一種活性很強(qiáng)、功能性齊全的天然糖類高分子化合物，是靈芝生長過程中奠基固本的重要因素之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗病毒、功能性產(chǎn)品加工等價(jià)值[5-9]，具有更深層的開發(fā)潛力。

蘆葦，為禾本科多年生草本植物，在我國出產(chǎn)很豐富，具有很強(qiáng)的凈水能力，能夠大量吸附氮、磷、鉛、鉻等元素，是一種能夠創(chuàng)造巨大的生態(tài)價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的纖維植物。目前蘆葦在世界范圍內(nèi)主要用于醫(yī)療保健、畜牧業(yè)、建筑工業(yè)、造紙和人造棉[10-11]。盡管國內(nèi)對(duì)蘆葦?shù)难芯恳呀?jīng)取得一定的進(jìn)展，但目前蘆葦種群發(fā)生了前所未有的消退現(xiàn)象[12]，蘆葦資源的應(yīng)用存在局限性。使用蘆葦秸稈作為靈芝液體培養(yǎng)的碳源，優(yōu)化靈芝液體培養(yǎng)液的配方及培養(yǎng)條件，根據(jù)發(fā)酵液的胞外多糖產(chǎn)量優(yōu)化其發(fā)酵工藝。既解決了蘆葦資源應(yīng)用的局限性、秸稈廢棄物污染環(huán)境的問題，又為靈芝多糖的生產(chǎn)提供了新的可能，為蘆葦秸稈-靈芝液體發(fā)酵技術(shù)的開發(fā)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

靈芝菌株G8，保藏于天津農(nóng)學(xué)院食用菌研發(fā)中心。

1.1.2 供試蘆葦秸稈

蘆葦秸稈，取自天津市薊州區(qū)于橋水庫前置庫。

蘆葦秸稈預(yù)處理方式：105℃殺青2 h后，放于80℃烘箱中烘干至恒重，自然冷卻至室溫后，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，備用。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、VB10.1 g，蒸餾水1 000 mL。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g、蛋白胨10 g、KH2PO41.5 g、MgSO40.75 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高產(chǎn)多糖液體培養(yǎng)基配方單因素篩選

1）碳源篩選：基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（無葡萄糖）分別添加蘆葦秸稈、玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈各5 g，以添加30 g葡萄糖為對(duì)照。搖床培養(yǎng)7 d，取樣檢測(cè)多糖產(chǎn)量，確定最適秸稈種類。

2）碳源添加量：將蘆葦秸稈加入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，作為發(fā)酵液唯一碳源。以不加葡萄糖的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，蘆葦秸桿在培養(yǎng)基中的配比分別設(shè)置為0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。搖床培養(yǎng)7 d，取樣檢測(cè)多糖產(chǎn)量。

3）氮源篩選：基培發(fā)酵培養(yǎng)基（無蛋白胨）分別添加尿素6 g、硫酸銨7 g、硝酸銨4 g、酵母浸粉7 g，以添加10 g蛋白胨為對(duì)照，進(jìn)行靈芝液體培養(yǎng)。搖床培養(yǎng)7 d，取樣檢測(cè)多糖產(chǎn)量。

4）氮源添加量：確定最佳氮源后，設(shè)置不同最佳氮源配比分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。搖床培養(yǎng)7 d，取樣檢測(cè)多糖產(chǎn)量。

5）初始pH：最優(yōu)培養(yǎng)條件在未發(fā)酵前調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，分別設(shè)置pH為3、4、5、6、7、8。

6）轉(zhuǎn)速：在最優(yōu)培養(yǎng)條件下設(shè)置搖床培養(yǎng)的不同轉(zhuǎn)速，分別為 110 r·min-1、130 r·min-1、150 r·min-1、170 r·min-1、190 r·min-1。

7） 溫度：設(shè)置不同培養(yǎng)溫度，分別為23℃、25℃、27℃、29℃、31℃。

1.3.2 靈芝液體發(fā)酵胞外粗多糖產(chǎn)量測(cè)定方法

取搖床培養(yǎng)至第7天的發(fā)酵液為測(cè)定對(duì)象，檢測(cè)靈芝胞外多糖產(chǎn)量。

發(fā)酵液過8層紗布，取過濾后的發(fā)酵液20 mL，4 000 r·min-1離心10 min。處理后的過濾液取5 mL于潔凈干燥的離心管中，緩慢加入4倍體積的無水乙醇并攪拌均勻，于4℃靜置醇沉24 h，每12小時(shí)搖勻。醇沉后將離心管置于6 000 r·min-1條件下離心8 min，倒去上清液，取沉淀。置于烘干箱中烘干至恒重，稱重計(jì)算其多糖含量[13-14]。

1.3.3 高產(chǎn)多糖液體培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素篩選試驗(yàn)，確定以每升液體培養(yǎng)基中蘆葦秸稈和硫酸銨的添加量及pH為因素，設(shè)計(jì)L9（33）的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Tab.1 Horizontal design of orthogonal test factors

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)靈芝多糖液體培養(yǎng)基單因素篩選試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響

選用不同的秸稈作為碳源，對(duì)泰山靈芝液體培養(yǎng)生產(chǎn)多糖的影響見圖1。

圖1 不同碳源條件下靈芝液體培養(yǎng)多糖產(chǎn)量的比較Fig.1 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different carbon sources

如圖1所示，添加不同秸稈種類作為培養(yǎng)基碳源均對(duì)靈芝多糖產(chǎn)生有促進(jìn)作用，且靈芝的多糖產(chǎn)量明顯高于對(duì)照組；而添加蘆葦秸稈的培養(yǎng)基中多糖產(chǎn)量大于添加其他種類秸稈的處理。多糖含量順序依次為：蘆葦秸稈（2.22 g·L-1）＞小麥秸稈（2.09 g·L-1）＞玉米秸稈（2.01 g·L-1）＞水稻秸稈（1.86 g·L-1）＞對(duì)照組（1.46 g·L-1）。因此，選擇蘆葦秸稈作為唯一碳源。

2.1.2 碳源配比對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響

蘆葦秸稈作為碳源，其不同配比對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響見圖2。

圖2 不同蘆葦秸稈添加量下靈芝液體培養(yǎng)多糖產(chǎn)量的比較Fig.2 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different amounts of reed straw addition

如圖2所示，液體培養(yǎng)泰山靈芝G8多糖產(chǎn)量最高的處理為添加0.5%蘆葦秸稈，其次為添加3%蘆葦秸稈；0.5%處理下多糖產(chǎn)量最多，達(dá)2.47 g·L-1，3%處理為2.31 g·L-1。由于碳源是作為靈芝生長的最主要營養(yǎng)成分，也是促進(jìn)液體發(fā)酵時(shí)靈芝多糖產(chǎn)出的主要因素之一，故選擇蘆葦秸稈添加量為正交試驗(yàn)的因素。

2.1.3 不同氮源對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響

使用不同氮源對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響見圖3。

圖3 不同氮源條件下靈芝液體培養(yǎng)多糖產(chǎn)量的比較Fig.3 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquidcultivation of Ganoderma lucidum under different nitrogen sources

如圖3所示，靈芝液體發(fā)酵條件對(duì)不同氮源的利用情況有較大差異。其中，酵母浸粉、硫酸銨的利用效果相對(duì)較高，蛋白胨、尿素的利用效果次之，硝酸銨利用效果最低。以硫酸銨為氮源的試驗(yàn)組多糖產(chǎn)量最大，為3.49 g·L-1。因此硫酸銨更有利于靈芝液體發(fā)酵時(shí)多糖的產(chǎn)生。

2.1.4 氮源配比對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響

選用硫酸銨作為氮源，其不同配比對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響見圖4。

圖4 不同硫酸銨添加量條件下靈芝液體培養(yǎng)多糖產(chǎn)量的比較Fig.4 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different ammonia sulfate additions

如圖4所示，隨著氮源添加量的增大，靈芝發(fā)酵液的多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)；配比為0.7%～1.3%時(shí)，多糖產(chǎn)量較大；其中，氮源配比為1%時(shí)多糖產(chǎn)量最大。在不同氮源添加量條件下，靈芝發(fā)酵的多糖產(chǎn)量各不相同，因此篩選合適的氮源添加量在提高靈芝發(fā)酵多糖產(chǎn)量上有較大的影響。因此，選擇氮源添加量作為正交試驗(yàn)的因素之一。

2.1.5 不同初始pH對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基不同初始pH對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5 不同初始pH條件下靈芝液體培養(yǎng)多糖產(chǎn)量的比較Fig.5 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different initial pH conditions

如圖5所示，隨著pH的增大，多糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；pH 7時(shí)多糖產(chǎn)量最大，為3.99 g·L-1。pH和溶解氧（DO） 是影響深層液態(tài)發(fā)酵靈芝菌絲體生長、代謝和靈芝多糖產(chǎn)生的重要因數(shù)，但目前對(duì)靈芝發(fā)酵過程中pH的研究都著眼于調(diào)節(jié)發(fā)酵初始pH，對(duì)發(fā)酵過程中的pH一般不作控制[15]。故選取初始pH作為正交試驗(yàn)的因素之一。

2.1.6 不同溫度對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6 不同溫度條件下靈芝液體培養(yǎng)多糖產(chǎn)量的比較Fig.6 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different temperature conditions

如圖6所示，當(dāng)溫度為27℃時(shí)多糖產(chǎn)量最大，為3.92 g·L-1。有研究表明，靈芝液體發(fā)酵的最適溫度為28℃[16]，可見最適溫度與文獻(xiàn)報(bào)道相近。因此，溫度可以作為靈芝液體培養(yǎng)的穩(wěn)定條件。

2.1.7 不同轉(zhuǎn)速對(duì)液體培養(yǎng)泰山靈芝多糖產(chǎn)量的影響

液體搖瓶培養(yǎng)泰山靈芝時(shí)，不同轉(zhuǎn)速對(duì)多糖產(chǎn)量的影響見圖7。

圖7 不同轉(zhuǎn)速條件下靈芝液體培養(yǎng)多糖產(chǎn)量的比較Fig.7 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different rotational speeds

由圖7所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速為170 r·min-1時(shí)多糖產(chǎn)量最大，為4.53 g·L-1。經(jīng)分析該處理具有顯著性差異。轉(zhuǎn)速的變化可以改變?nèi)苎鹾图羟辛Φ淖兓?，剪切力過大或溶氧不足都會(huì)對(duì)菌絲體的生長造成不良影響；適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速能夠增大發(fā)酵過程中的溶氧性，有利于靈芝產(chǎn)糖的積累[17]。轉(zhuǎn)速不宜過高或過低，因此為達(dá)到穩(wěn)定的培養(yǎng)條件，選擇170 r·min-1轉(zhuǎn)速為靈芝液體培養(yǎng)條件。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Analysis of orthogonal test results

由表2可知，最佳的培養(yǎng)基配方為A1B3C3；即每升液體培養(yǎng)基中蘆葦秸稈的添加量為10 g，其配比為0.3%，每升液體培養(yǎng)基中硫酸銨的添加量為13 g，其配比為1.3%，pH為8。最佳配方為試驗(yàn)中第2組組合，該組合處理下多糖產(chǎn)量為10.8 g·L-1，明顯高于其他各組；且其菌絲球小而緊密，分布均勻。

靈芝液體發(fā)酵過程中的主要營養(yǎng)物質(zhì)包含碳源、氮源、礦物質(zhì)、維生素等，其中碳源是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的基本元素，為靈芝生長發(fā)育產(chǎn)生活性物質(zhì)提供基本能量[18]。蘆葦秸稈作為一種復(fù)合有機(jī)物質(zhì)，不僅為靈芝液體發(fā)酵提供生長所需的碳源，也為靈芝液體發(fā)酵提供其他所需的營養(yǎng)物質(zhì)。低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的低剪切力會(huì)影響發(fā)酵液混合以及氧傳遞，導(dǎo)致溶氧量降低，從而使發(fā)酵效果降低[19]，影響靈芝多糖的產(chǎn)出；而加入蘆葦秸稈可以使發(fā)酵液粘稠、充滿顆粒感，進(jìn)而使搖瓶中的剪切力、溶氧性大大增加，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，菌絲產(chǎn)多糖量顯著提高。除此之外，氮源也是作為靈芝菌絲體生長的必要元素，通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)中對(duì)氨源的選擇有較大差異，其中添加硫酸銨作為氮源的是靈芝發(fā)酵液及糖含量最高，因此選擇硫酸銨作為靈芝液體發(fā)酵的氮源，并通過調(diào)節(jié)硫酸銨的添加量來篩選最適宜靈芝液體發(fā)酵的培養(yǎng)基氮源。

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

如表3所示，蘆葦秸稈添加量對(duì)液體培養(yǎng)靈芝的多糖產(chǎn)量無顯著性差異，但硫酸銨添加量和培養(yǎng)基初始pH對(duì)多糖產(chǎn)量具有極顯著差異。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)正交試驗(yàn)篩選出的組合進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比Fig.8 Comparison of verification test results

如圖8所示，在A1B3C3組合條件下培養(yǎng)的菌絲體胞外多糖含量為10.82 g·L-1，與正交試驗(yàn)結(jié)果相近，誤差不超過2%，具有良好的重現(xiàn)性。驗(yàn)證結(jié)果較優(yōu)化前的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基比，多糖含量有明顯提高，提高4.41倍。

3 結(jié)論與討論

報(bào)道的研究中，靈芝液體發(fā)酵的碳源、氮源以及pH對(duì)靈芝液體發(fā)酵胞外多糖的產(chǎn)出均有重要意義。不同pH對(duì)靈芝菌絲體的生長發(fā)育和多糖產(chǎn)出有不同的影響；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，pH為8時(shí)多糖產(chǎn)量最大，這與劉冬等[15]多糖含量最佳pH為5.6的結(jié)果不同；但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH＞5.6時(shí)，多糖產(chǎn)量雖微低于pH 8時(shí)的產(chǎn)量，但均會(huì)趨于一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)值，出現(xiàn)這種差異可能是由于蘆葦秸稈的理化性質(zhì)引起。另有報(bào)道pH影響多糖的提取，在堿性條件下可更充分地提取多糖[20]。

首次將蘆葦秸稈作為液體發(fā)酵液的變化成分，控制其他參數(shù)（包括培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量等） 不變，以提高胞外多糖產(chǎn)量為目標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化靈芝液體發(fā)酵液的配方發(fā)酵條件，優(yōu)化靈芝液體發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)基中蘆葦秸桿配比為0.3%、硫酸銨配比為1.3%、pH 8、轉(zhuǎn)速170 r·min-1、溫度27℃的條件下，液體發(fā)酵靈芝的胞外多糖產(chǎn)量最高，為10.82 g·L-1；相比基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)化效果明顯，較優(yōu)化前提高了4.41倍；且試驗(yàn)具有較好的重復(fù)性。另外，添加蘆葦秸稈發(fā)酵出的菌絲體形狀相比基礎(chǔ)培養(yǎng)液發(fā)酵出的菌絲體更緊實(shí)、細(xì)密，利用其作為原種進(jìn)行栽培后可以正常出芝。該試驗(yàn)的結(jié)果為蘆葦秸稈資源利用及靈芝液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)指導(dǎo)。