王 月，任梓銘，于延申

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130000）

長(zhǎng)根菇[Hymenopellis raphanipes（Berk.）R.H.Petersen]隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 膨瑚菌科（Physalacriaceae） 小奧德蘑屬 （Hymenopellis）[1]，又名長(zhǎng)根小奧德蘑、露水雞地從[2]等，俗稱“黑皮雞地從菌”，是新近商業(yè)化栽培的熱點(diǎn)食用菌[3]。該菌曾被誤認(rèn)作長(zhǎng)根奧德蘑（Oudemansiella radicata）、鱗柄小奧德蘑 （Oudemansiella furfuracea） 及雞地從菌（Termitomyces albuminosus），Hao等[4]2016年將該菌認(rèn)定為卵孢小奧德蘑（Oudemansiella raphanipes），分類學(xué)研究中將其歸為小奧德蘑屬（Hymenopellis）[5]。

長(zhǎng)根菇味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有預(yù)防種瘤、抑制幽門螺旋桿菌等作用[6]，子實(shí)體中含有的長(zhǎng)根菇素（Oudenone）具有一定的降血壓作用[7]，深受消費(fèi)者喜愛。目前，對(duì)長(zhǎng)根菇優(yōu)良菌株篩選的報(bào)道較少，因此，從全國(guó)范圍內(nèi)收集了8個(gè)長(zhǎng)根菇栽培菌株，對(duì)菌株進(jìn)行ITS序列測(cè)定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其種源信息，排除同物異名現(xiàn)象。通過考察記錄子實(shí)體形態(tài)和農(nóng)藝性狀，對(duì)長(zhǎng)根菇菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)篩選出適合吉林省栽培、具有品種改良價(jià)值的優(yōu)質(zhì)菌株，為長(zhǎng)根菇育種提供資源儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

8個(gè)供試長(zhǎng)根菇菌株分別命名為HYA、HYB、HYC、HYE、HYF、HYG、HYH、HYI，其來源詳見表1。

表1 供試菌株來源Tab.1 The source of the tested strains

1.1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH自然。液體菌種培養(yǎng)基：1 L液體培養(yǎng)基加豆柏粉 7 g、葡萄糖 20 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、維生素B112 mg、消泡劑（C2H6OSi乳液）0.2 mL～0.4 mL、輕質(zhì)碳酸鈣適量，pH調(diào)整至約6.5，加水至1 L。栽培種培養(yǎng)基：棉籽殼20%、木屑44%、玉米芯20%、麥麩15%、石灰1%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分子生物學(xué)鑒定

1） 基因組DNA提取

無菌條件下，刮取PDA平板上的新鮮菌絲作為試驗(yàn)材料，以DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA。

式中，yi為實(shí)驗(yàn)結(jié)果；n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)；m為目標(biāo)值。在某些特例下，鈦合金介觀尺度銑削表面粗糙度傾向于望目特性或望大特性。例如，生物醫(yī)用材料表面粗糙度影響細(xì)胞黏附，各局部區(qū)域表面粗糙度需要控制在一定的范圍內(nèi)，并非越小越好。除此之外，對(duì)于零件表面粗糙度期望往往傾向于更小，符合望小特性。本文的優(yōu)化目標(biāo)是使各區(qū)域銑削表面粗糙度趨向于更小，各銑削區(qū)域表面粗糙度測(cè)量結(jié)果和信噪比計(jì)算結(jié)果如表5所示。

2） ITS序列擴(kuò)增

引物選擇真菌ITS通用引物ITS1和ITS4，PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PCR反應(yīng)混合物25 μL，引物（0.2 μmol·L-1）各1.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 21 μL。在PCR儀上擴(kuò)增，程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸8 min。

3）ITS序列測(cè)定、比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和引物，由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用BLAST在線比對(duì)工具進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 拮抗試驗(yàn)

在滅菌的超凈工作臺(tái)上，用母種培養(yǎng)基倒平板，至培養(yǎng)基完全鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，厚度不宜過大，以方便后期試驗(yàn)觀察。將制備好的培養(yǎng)基平板底部劃分為2塊區(qū)域，并隨機(jī)組合2個(gè)不同編號(hào)的菌株，用無菌操作接種技術(shù)，將對(duì)應(yīng)編號(hào)的菌株接種于相應(yīng)區(qū)域中央，使其相距2 cm～3 cm，做好標(biāo)記并封口，后將平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待平板長(zhǎng)滿菌絲后，觀察菌株間的拮抗情況。

1.2.3 菌絲生長(zhǎng)情況比較

在滅好菌的超凈工作臺(tái)中，使用母種培養(yǎng)基倒平板，采用無菌操作打孔接種技術(shù)，用7 mm的滅菌打孔器取相同菌齡的供試菌株，接種于培養(yǎng)基平板中央，每組3個(gè)重復(fù)，做好標(biāo)記并封口。將接種好的平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，采用“十”字交叉法，每24小時(shí)測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。菌絲平均生長(zhǎng)速度（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：D表示菌落直徑（mm）；d表示培養(yǎng)天數(shù)（d）。

按照配方備料，原材料用清水預(yù)濕處理12 h～24 h后，將各種原料加水充分?jǐn)嚢杈鶆?，培養(yǎng)料含水量60%～65%，pH 6.0～7.0。菌袋用17 cm×33 cm×0.03 cm的高密度低壓聚乙烯塑料袋，裝料松緊適度、均勻一致（每袋濕料1.2 kg）。常壓滅菌4 h，當(dāng)料內(nèi)溫度達(dá)100℃后，保持恒溫15 h～20 h。滅菌后的料袋放入事先用氣霧消毒劑熏蒸好的接種室，待料溫降至30℃以下后，在超凈臺(tái)內(nèi)接種。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)長(zhǎng)3 m、寬1 m、深20 cm的畦床，畦間留50 cm～60 cm的操作道。將菌袋脫去塑料袋，直立排放在畦內(nèi)，細(xì)土粒填滿空隙，上面覆蓋4 cm～5 cm的土壤。出菇管理參照參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.5 測(cè)定指標(biāo)

在長(zhǎng)根菇整個(gè)生育期，調(diào)查菌絲至子實(shí)體階段共15個(gè)農(nóng)藝性狀，性狀指標(biāo)及調(diào)查方法參照NY/T 3715-2020植物品種特異性（可區(qū)別性）、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 長(zhǎng)根菇[9]，詳見表2。

表2 供試菌株農(nóng)藝性狀測(cè)定方法Tab.2 Assay methods of agronomic traits of tested strains

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010做基本數(shù)據(jù)記錄和處理，計(jì)算每個(gè)性狀的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），根據(jù)所得結(jié)果分析各性狀的遺傳差異程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子鑒定結(jié)果

測(cè)序結(jié)果使用BLAST在線比對(duì)工具進(jìn)行序列分析，當(dāng)與已知序列相似性≥99%時(shí)，即可判定為同一物種，8株長(zhǎng)根菇的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見圖1。

圖1 基于ITS rDNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 NJ phylogentic tree based on rDNA ITS sequence

由圖1結(jié)果顯示，所測(cè)8個(gè)樣品均為長(zhǎng)根菇。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載Hymenopellis屬多個(gè)種的ITS序列，選擇Psathyrella candolleana（Fr.）Maire作為外類群，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。供試的8個(gè)菌株與下載的Hymenopellis屬序列聚成一類，黃白小脆柄菇（Psathyrella candolleana） 單獨(dú)為一個(gè)分支，其中HYA、HYB、HYG、HYF、HYC、HYE 6株菌株親緣關(guān)系相對(duì)較近，與HYH、HYI親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，HYA與HYI親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.2 拮抗試驗(yàn)

將8個(gè)菌株兩兩隨機(jī)組合，無菌操作打孔接種于平板中，25℃下恒溫暗光培養(yǎng)，觀察菌株拮抗反應(yīng)，其結(jié)果見表3。

表3 供試長(zhǎng)根菇菌株拮抗反應(yīng)結(jié)果Tab.3 Antagonistic test results of Hymenopellis raphanipes

由表3結(jié)果顯示，28個(gè)組合中有15組有拮抗反應(yīng)，HYI與其余7個(gè)菌株均有拮抗反應(yīng)，HYF、HYG和HYH均與HYC、HYE有拮抗反應(yīng)，HYE與HYC有拮抗反應(yīng)，HYC與HYB有拮抗反應(yīng)。

2.3 菌絲生長(zhǎng)情況比較

結(jié)合拮抗反應(yīng)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析，排除同物異名菌株，選擇HYC、HYE、HYH、HYI進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)情況比較和農(nóng)藝性狀比較試驗(yàn)，比較不同菌株在PDA培養(yǎng)基上及菌袋中菌絲生長(zhǎng)速度，結(jié)果見表4。

表4 供試長(zhǎng)根菇菌株菌絲生長(zhǎng)情況Tab.4 Mycelial growth situation of Hymenopellis raphanipes

由表4可知，不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速度不同，但在0.05和0.01水平上差異均不顯著。菌絲的濃密程度有差異，其中HYE菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，且栽培種滿袋時(shí)間最短，僅需30 d，HYH菌絲生長(zhǎng)速度最慢，滿袋時(shí)間需40 d。

2.4 子實(shí)體形態(tài)特征比較

按照1.2.5調(diào)查方法對(duì)4株長(zhǎng)根菇菌株子實(shí)體階段形態(tài)特征進(jìn)行比較，對(duì)菌蓋顏色、茸毛密度、菌蓋直徑和厚度、菌柄長(zhǎng)度和直徑等性狀進(jìn)行記錄，結(jié)果見表5。

表5 供試長(zhǎng)根菇菌株子實(shí)體形態(tài)特征比較Tab.5 Fruit body morphology of Hymenopellis raphanipes

由表5中數(shù)據(jù)可知，不同菌株菌柄形狀及顏色差異不大，均為柱狀，深褐色。菌株HYH菌蓋呈中等褐色，HYC、HYE、HYI菌蓋均為深褐色。菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑性狀內(nèi)存在不同程度的遺傳變異，其中以菌蓋直徑的變異最為廣泛，變異系數(shù)范圍為0.08～0.16。

2.5 農(nóng)藝性狀分析

試驗(yàn)選擇菌株的農(nóng)藝性狀分析結(jié)果見表6。

表6 供試長(zhǎng)根菇菌株農(nóng)藝性狀比較Tab.6 Agronomic trait of Hymenopellis raphanipes

由表6可知，不同菌株原基出現(xiàn)的時(shí)間不同，HYE最早出現(xiàn)原基，為33 d；HYI原基分化最遲，為46 d。HYC、HYE子實(shí)體形成最快，僅需3 d，與最慢的HYH菌株相差2 d。HYE單位面積產(chǎn)量最高，HYC次之，HYI單位面積產(chǎn)量最低。HYI平均單菇重最高，HYE次之，HYC平均單菇重最低，由單位面積產(chǎn)量及平均單菇重?cái)?shù)據(jù)比較可知，二者間無直接相關(guān)性。HYE生物學(xué)效率最高，可達(dá)63.6%，HYC次之，HYI生物學(xué)效率最低，僅為37.3%。在數(shù)據(jù)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，HYI第三潮菇產(chǎn)量約為第一潮的三分之一，出菇后期菌絲活力明顯減弱。

3 討論

菌絲生長(zhǎng)階段，各菌株菌絲生長(zhǎng)速度差異不顯著，但HYE菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，栽培種滿袋時(shí)間最短。出菇階段，供試的4株菌株子實(shí)體形態(tài)差異不大，HYI子實(shí)體平均單菇重最大，但出現(xiàn)原基時(shí)間最遲，生物學(xué)效率最低。HYE最早出現(xiàn)原基，且單位面積產(chǎn)量最高，菌蓋及菌柄緊實(shí)度偏硬，易于存儲(chǔ)和運(yùn)輸，篩選出HYE為優(yōu)良菌株，可進(jìn)一步在吉林省推廣栽培。

HYI雖原基出現(xiàn)最遲，單位面積產(chǎn)量最低，但子實(shí)體平均單菇重最高，HYC在母種培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)速最快，子實(shí)體形成時(shí)間最短，但平均單菇重最低。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，HYI與HYC親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，在今后的育種工作中，可將HYC與HYI菌株作為品種改良的親本，以培育出性狀更加優(yōu)良的長(zhǎng)根菇菌株。