何淑嫻 ，文華樞 ，謝德春 ，李友余 ，李超榮 ，劉志發(fā) ，張朝明，吳天民，宋 斌，莫美華

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2．廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；3．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽 421001；4．廣東云開山省級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，廣東 信宜 525343；5．廣東南嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，廣東 乳源 521727）

粉褶蕈屬（Entoloma）是大型真菌中的世界廣泛分布屬，在分類學(xué)上隸屬于真菌界（Fungi）擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目（Agaricales） 粉褶蕈科 （Entolomataceae）。該屬種類繁多，分布廣泛，全世界已報(bào)道的約1 800種，某些種已知具有食用和藥用或有毒的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。中國地域遼闊，地形復(fù)雜，氣候各異，南北溫差大，具有豐富的真菌物種多樣性，已報(bào)道的粉褶蕈屬種類超過100個(gè)，包括一些新種[4-19]。

通過對(duì)廣東云開山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及廣東南嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行大型真菌資源調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一中國新記錄種——比杜普粉褶蕈（Entoloma bidupense），現(xiàn)描述報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試標(biāo)本

標(biāo)本GDGM 76710和GDGM 76742采自廣東云開山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，GDGM 86876采自廣東南嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。野外采集時(shí)首先對(duì)新鮮的子實(shí)體及生境進(jìn)行拍攝，然后將子實(shí)體放入采集袋中帶回駐地；取一小塊干凈的子實(shí)體組織放入裝有吸水硅膠中作為分子材料備用，記錄其子實(shí)體的宏觀形態(tài)特征和生境信息；余下放入烘箱50℃烘干至恒重，干燥后的標(biāo)本用自封袋保存。研究標(biāo)本保藏于廣東省科學(xué)院微生物研究所真菌標(biāo)本館（The Fungal Herbarium of Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Academy of Sciences，GDGM）。

1.2 主要試劑和設(shè)備

主要試劑：硅膠，廣州化學(xué)試劑廠；真菌DNA小量提取試劑盒，廣州美基生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增試劑，北京全式金科技有限公司。

主要設(shè)備：水浴鍋，托普儀器有限公司；研磨儀，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Olympus BX51光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 形態(tài)學(xué)研究

依據(jù)對(duì)新鮮標(biāo)本和野外拍攝照片及其觀察記錄（包括菌蓋、菌肉、菌褶、菌柄等的形態(tài)、大小和顏色）進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征描述。顏色描述依據(jù)參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。顯微結(jié)構(gòu)觀察描述是對(duì)烘干標(biāo)本進(jìn)行觀察、拍照和記錄：使用雙面刀片切取目標(biāo)組織塊，用5%的KOH溶液復(fù)水、1%剛果紅和碘試劑進(jìn)行顯微制片，觀察、測量、記錄擔(dān)孢子、擔(dān)子、囊狀體、菌蓋皮層及菌絲結(jié)構(gòu)等的顯微結(jié)構(gòu)特征。具體參照何曉蘭等和李傳華等的方法[4，9，12]。

1.4 分子系統(tǒng)學(xué)研究

用Magen真菌DNA小量提取試劑盒提取子實(shí)體DNA；采用真核生物通用引物 ITS1/ITS4（ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′； ITS4:5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為 12.5 μL PCR Mix，上下游引物各 1 μL，DNA模板 1 μL，加ddH2O至 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5 min；95℃變性30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保溫[14]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測后，送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。核對(duì)獲得的ITS序列峰圖，確認(rèn)堿基的準(zhǔn)確性，并對(duì)序列進(jìn)行雙向拼接。將拼接的序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇同源性較高的相關(guān)序列，結(jié)果見表1。

表1 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建所用標(biāo)本信息Tab.1 Specimens information used for phylogenetic tree construction

選擇表1中的序列，采用PhyloSuite vl.2.2軟件基于最大似然法（Maximum Likelihood，ML） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]，選取耳狀斜蓋傘（Clitopilus hirneolus）作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外類群[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本信息

標(biāo)本GDGM 76710：采集時(shí)間2019-07-23；采集地廣東省信宜市云開山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)大田頂天池 （22°13′59″N～22°21′23″N，111°08′19″E～111°23′45″E，海拔1 200 m）；采集人宋斌、李驥鵬、文華樞。

標(biāo)本GDGM 76742：采集時(shí)間2019-07-23；采集地廣東省信宜市云開山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)大田頂天池 （22°13′59″N～22°21′23″N，111°08′19″E～111°23′45″E，海拔1 200 m）；采集人宋斌、李驥鵬、文華樞。

標(biāo)本GDGM 86876：采集時(shí)間2021-07-31；采集地廣東南嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)稱架滑沖坑（24°76′63.2″N，113°05′91.3″E，海拔 150 m）；采集人宋斌、何淑嫻、謝德春、鐘國瑞。

世界分布：中國、越南[22]。由調(diào)查得知，樣品菌類夏秋季單生或散生于常綠混交林的土壤上。

2.2 形態(tài)特征描述

比杜普粉褶蕈（Entoloma bidupense O.V.Morozova&E.S.Popov） 新鮮子實(shí)體形態(tài)特征見圖1。

圖1 比杜普粉褶蕈子實(shí)體Fig.1 Fruit body of Entoloma bidupense

如圖1所示，子實(shí)體中等大小，近杯傘狀至口蘑狀，深藍(lán)色至漸變棕藍(lán)色；菌蓋直徑約1.5 cm～4.5 cm，初期半球形，邊緣彎曲，然后凸出到平凸，中心略微凹陷，至稍平展，成熟時(shí)或撕裂，表面密布微小鱗片，深藍(lán)色至成熟時(shí)漸變灰棕色，蓋緣鱗片顏色變淺；菌肉近米白色至淺灰白色；菌褶直生，稍微缺失至微齒狀，白色至米粉紅色，具流蘇狀淺藍(lán)色邊緣；菌柄（40～70） mm×（4～6） mm，中生，圓柱形至近圓柱形，等粗或向下稍漸粗，或具縱向溝紋，與菌蓋同色或顏色稍淺，頂端稍白，纖維狀至鱗片狀，基部被白色絨毛；未見菌環(huán)；子實(shí)體氣味和味道不明顯。

比杜普粉褶蕈的孢子菌蓋、菌褶等顯微觀察結(jié)果見圖2。

圖2 比杜普粉褶蕈的顯微特征Fig.2 Microscopic characteristics of Entoloma bidupense

如圖 2所示，擔(dān)孢子 （9.3～12.0） μm×（5.8～8.4） μm，孢子的長寬比Q=1.2～1.7（異徑），具有5角或6角，側(cè)面角度稍為明顯；擔(dān)子（35.7～46.5）μm×（8.4～11.3） μm，窄棍棒狀至近圓柱形，具4個(gè)擔(dān)子小梗，具鎖狀聯(lián)合；不育擔(dān)子近圓柱形，褶緣異質(zhì)；褶緣囊狀體 （35.8～117） μm × （6.6～13.8）μm，圓柱形、棍棒狀至寬燒瓶狀，末端具藍(lán)色色素或無；側(cè)生囊狀體未見；菌蓋皮層近毛皮狀，末端菌絲圓柱形，直徑12 μm～17 μm，具鎖狀聯(lián)合。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)Blast比對(duì)分析，研究標(biāo)本GDGM 76710、GDGM 76742、GDGM 86876與E.bidupense模式標(biāo)本的ITS序列相似度分別達(dá)99.38%、99.01%、99.48%。通過文獻(xiàn)查閱，研究標(biāo)本GDGM 76710、GDGM 76742、GDGM 86876和E.bidupense模式標(biāo)本的ITS序列，以及其他粉褶蕈屬物種的ITS序列，以Clitopilus hirneolus為外類群，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于最大似然法構(gòu)建的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of ITS sequences based on Maximum Likelihood method

如圖3所示，3個(gè)研究標(biāo)本與E.bidupense聚為一個(gè)分支，自展支持率（bootstrap value，BS） 為100%，確認(rèn)為同一個(gè)物種。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)形態(tài)特征比較和分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析，3份標(biāo)本鑒定結(jié)果應(yīng)為比杜普粉褶蕈E.bidupense，經(jīng)查證為中國新記錄種。

研究標(biāo)本與產(chǎn)地為越南的比杜普粉褶蕈模式標(biāo)本的形態(tài)特征基本相同[22]。生境方面，研究標(biāo)本采集于海拔150 m～1 200 m的常綠混交林的土壤及道路邊樹林的土壤，而比杜普粉褶蕈的模式標(biāo)本采集于越南中部比杜普努巴國家公園附近的海拔約1 600 m的常綠混交林下土壤。比杜普粉褶蕈E.bidupense在形態(tài)上與布拉赫粉褶蕈（E.bulakhae） 非常相似，區(qū)別在于比杜普粉褶蕈E.bidupense菌蓋深藍(lán)色至灰棕色，菌蓋稍凹陷，非臍狀，菌褶直生，E.bidupense菌蓋紫羅蘭色至灰紫羅蘭色，菌蓋中央明顯凹陷，臍狀，菌褶延生。比杜普粉褶蕈E.bidupensee在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與紫紋粉褶蕈（E.vio-laceozonatum）關(guān)系密切，在形態(tài)上比較相似，皆具流蘇狀菌褶邊緣和具鎖狀聯(lián)合的擔(dān)子；但比杜普粉褶蕈E.bidupense菌蓋稍凹陷，非臍狀，菌柄鱗片纖毛狀、小鱗片狀，而紫紋粉褶蕈E.violaceozonatum菌蓋中央明顯凹陷，臍狀，菌柄鱗片細(xì)條紋狀；并且兩者在地理分布上也有足夠的差異，比杜普粉褶蕈E.bidupense模式產(chǎn)地為越南，紫紋粉褶蕈E.violaceozona-tum僅見于歐洲[22,25]。此外，比杜普粉褶蕈E.bidupense在形態(tài)上與報(bào)道于廣東的藍(lán)鱗粉褶蕈（E.azureosquamulosum） 也比較相似[11]，區(qū)別在于比杜普粉褶蕈E.bidupense菌蓋深藍(lán)色至灰棕色，褶緣囊狀體棍棒狀至寬燒瓶狀，而藍(lán)鱗粉褶蕈E.azureosquamulosum菌蓋顏色為帶紫色色調(diào)的深藍(lán)色，密被鱗片，褶緣囊狀體梭形至紡錘形，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上，兩者系統(tǒng)發(fā)育位置具有明顯的區(qū)別。

粉褶蕈屬真菌廣布于世界各地，是溫帶和熱帶地區(qū)真菌區(qū)系的重要組成部分[4]。廣東云開山國家級(jí)保護(hù)區(qū)地處熱帶和亞熱帶過渡區(qū)域，廣東省南嶺國家自然保護(hù)區(qū)屬中亞熱帶濕潤型季風(fēng)氣候，2個(gè)國家級(jí)保護(hù)區(qū)均是中國南方地區(qū)高等真菌資源分布及生物多樣性研究的重要地域[26-28]。比杜普粉褶蕈E.bidupense作為中國新記錄種首次在2個(gè)保護(hù)區(qū)的發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充了我國粉褶蕈物種的種類及分布區(qū)域，為粉褶蕈屬的物種多樣性和潛在的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值積累了科學(xué)資料。