朱嘉妮 蘇勤

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)學院 成都 610041；

2.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 成都 610041

難治性根尖周炎（refractory apical periodontitis，RAP）是指通過規(guī)范的根管治療后，仍不能徹底清除根管內或根尖外感染，并有臨床癥狀和/或影像學表現的慢性根尖周炎,又稱持續(xù)性根尖周炎（persistent apical periodontitis，PAP）[1]。RAP的難治性偏重治療難度，而PAP的持續(xù)性偏重病理改變。RAP根管內外的細菌較原發(fā)感染根管有所不同。許多學者運用不同取樣方式及檢測技術研究了RAP感染的細菌特異性，所獲得的菌群種類存在局限性和差異性。

隨著取樣方法及分子檢測技術的不斷更新，本文總結了近十年相關研究，對采用不同技術手段獲得的RAP根管內與根尖外菌群檢測結果的共性與差異作一綜述。

1 根管內優(yōu)勢菌的檢出

1.1 樣本獲取

從根管取樣是為了獲得根管系統(tǒng)中的細菌樣本，但不同的取樣方法均難以完全復原根管中的細菌種類，故選擇合適的取樣方法一直是細菌檢測的重要問題。一直以來被廣泛使用的方法是去除根管充填物后用無菌紙尖從根管內取樣，但研究者大多認為其在取樣的范圍和深度上存在局限性。不同于在主根管中較易被蘸取的浮游細菌，許多細菌定植于牙本質小管深處、根管峽部等，或形成生物膜，很難通過紙尖獲得[2]；去除根管填充物后，黏附在牙膠上的細菌同時被去除，因此細菌豐度可能被低估；根管樣本也不能提供感染根管不同部位的細菌種類與數量差異的信息。

從根管內取樣的文獻大多以紙尖取樣為主，并得到了相似的優(yōu)勢菌群。但也有研究者采用不同的取樣方式。Bouillaguet等[3]用K銼從拔牙后切下的5 mm根尖的根管內取樣，結果與根管內紙尖取樣基本相同；Karygianni等[4]將充填材料的取樣與紙尖取樣相結合，在充填材料中還檢測出小韋榮球菌、副血鏈球菌、黏滑羅斯菌3個類群。

單一紙尖取樣有一定的局限性，結合充填材料取樣可更有效、更加全面獲得根管內的定植細菌。

1.2 檢測方法

細菌檢測方法主要分為細菌培養(yǎng)法與非培養(yǎng)方法。這兩種方法的結果有時并不相同，但可相互補充。隨著現代分子技術的快速發(fā)展，單獨采用細菌培養(yǎng)法的研究越來越少，但也不能忽視其價值。

1.2.1 細菌培養(yǎng)法 細菌培養(yǎng)法是傳統(tǒng)的細菌鑒定與研究的基礎實驗方法，但有許多局限性，如僅有40%～50%的口腔細菌可以培養(yǎng)。Medina-Palacios等[5]單獨采用厭氧細菌培養(yǎng)鑒定15例RAP樣本得到26種細菌，88.5%屬于兼性厭氧，11.5%屬于專性厭氧。

1.2.2 非培養(yǎng)方法 不斷更新的分子技術因其高靈敏度、特異性和高通量等特點，能夠鑒定可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細菌。分子生物技術大多數為定性檢測，也存在一些缺點，如聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和克隆分析會由于能從死細胞中檢測DNA、差異DNA提取或優(yōu)先DNA擴增而導致一些偏倚，這可能會高估某些物種的作用，同時低豐度菌株的DNA可能丟失。目前，常用于鑒定根管感染的分子技術包括PCR、DNA-DNA雜交、焦磷酸測序等[6]。

PCR可用于從多個DNA分子的混合物中復制某個細菌特異性的DNA鏈。應用PCR技術，張富華等[7]在20例患者中共發(fā)現15種細菌，其中糞腸球菌出現頻次最高，微小單胞菌次之。孫慧斌等[8]在40例樣本中發(fā)現檢出率最高的也是糞腸球菌，還有中間普雷沃菌、牙齦卟啉單胞菌等。巢式PCR也曾被Barbosa-Ribeiro等[9]采用。

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16SrRNA基因有一個精確比對的保守區(qū)域，有助于對感染根管進行更詳細的細菌篩選。運用16SrRNA基因測序，Cardoso等[10]檢測到了牙髓卟啉單胞菌、連翹銀斑菌、牙齦卟啉單胞菌、齒密螺旋體。

高通量焦磷酸測序是一種基于“合成測序”原理的DNA測序方法，它一次處理的數據量與采樣深度前所未有，可以檢測到豐度很低的細菌，并有效地區(qū)分細菌種類。王娟等[11]采用PCR與焦磷酸測序法檢測得到了厚壁菌門、螺旋體門等。

此外，熒光原位雜交[6]、下一代測序技術、聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等分子技術也在近年的微生物研究中被廣泛應用。Sánchez-Sanhueza等[2]用下一代測序技術檢測到RAP中細菌最豐富的家族是假單胞菌科，細菌數量最多的是變形菌門；何洪旭等[12]用PCR-DGGE檢測得到糞腸球菌、普氏消化鏈球菌等。

1.2.3 細菌培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法對比 研究表示：兩種方法檢測的細菌類群相似，但非培養(yǎng)技術發(fā)現的細菌多樣性更高，也更易發(fā)現一些之前并未獲得過的細菌。Anderson等[13]將兩種方法相結合檢測21例樣本，發(fā)現的26個類群主要屬于厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門，兩法檢測到的微生物區(qū)系多樣性非常相似，其中培養(yǎng)法在充填根管內檢測到細長奈瑟菌、口腔放線菌、細棒狀桿菌、變形桿菌和魯梅爾芽胞桿菌5個菌屬，PCR也發(fā)現了雞腸球菌、加氏乳桿菌、歐陸森氏菌等8種細菌。Endo等[14]也同時采用兩種方法檢測同一樣本共15例，得到的結果并不一致，通過培養(yǎng)發(fā)現最常見的細菌為葡萄球菌、放線菌、孿生球菌、嗜血桿菌和腸球菌；而PCR檢出最多的菌種為微小單胞菌、變黑普雷沃氏菌、糞腸球菌和麻疹芽胞菌。通過更新的分子技術發(fā)現了之前的培養(yǎng)法中少見的專性厭氧致病菌如卟啉單胞菌屬、消化鏈球菌屬、普雷沃氏菌屬等，這對將來更好地研究其致病機制及臨床癥狀起了一定作用[15]。

培養(yǎng)法不能培養(yǎng)所有細菌，而分子技術雖可鑒定不能被培養(yǎng)的細菌，獲得更高的細菌多樣性，但也有許多缺陷。無論是用哪種技術培養(yǎng)或檢測都可能有未被檢測到的物種，且檢測到的物種也仍未發(fā)現其確切的臨床相關性[16]。兩者結合使用可以相互補充，獲得更完善的結果，發(fā)現更多種類與數量的細菌。

1.3 優(yōu)勢菌

RAP中感染菌群復雜，最主要的細菌是革蘭氏陽性（Gram-positive，G+）菌，以兼性厭氧G+球菌和棒狀菌為主，有學者[3]報道G+菌對化學-機械處理更有抵抗力，可長期處于低代謝活性的靜止期。還有不同的革蘭氏陰性（Gram-negative，G-）厭氧菌，也在RAP中起重要作用。在對RAP根管內樣本的研究中發(fā)現檢出率高的細菌種類大致相同，最常被檢出且豐度最高的有厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門。群落的多樣性表明，細菌可能形成群落組合導致根尖周組織的持續(xù)炎癥，而不是由特定的細菌種類導致[15-16]。

放線菌門是口腔正常共生菌群，為厭氧G+桿菌，在原發(fā)性和繼發(fā)性感染中都存在，幾乎在所有RAP根管內都被檢測到。變形菌門包括常見的奈氏球菌目、伯克氏菌屬、腸桿菌科和假單胞菌科等。梭桿菌門是一小類嚴格的專性厭氧G-菌，常見于消化道，是口腔正常菌群，也可導致根尖周病；其中，包括核梭桿菌、具核酸桿菌等。擬桿菌門是專性厭氧G-桿菌，包括根尖周炎常見的卟啉單胞菌屬，在Cardoso等[10]的研究中，牙髓卟啉單胞菌是根管中檢出最多的菌種，其次是牙齦卟啉單胞菌等。Sánchez-Sanhueza等[2]發(fā)現：細菌最豐富的家族是假單胞菌科，細菌數量最多的是變形菌門，其次是擬桿菌門；變形菌門在有癥狀患者中比無癥狀患者中豐度更高，而擬桿菌門在無癥狀患者中豐度更高。

原發(fā)性根尖周炎中G+菌和G-菌各半，嚴格的厭氧細菌占主導，有5～12個屬[23]。而RAP存在的主要原因是根管治療后根管內或根尖外殘留菌群的持續(xù)感染，或其他各種原因導致的繼發(fā)感染，兼性厭氧G+菌占主導地位，故RAP中的部分菌群尤其是G+菌多是繼承原發(fā)性根尖周炎而來，種類減少而豐度降低，剩余的是抗藥性強且難以去除的細菌，尤其是腸球菌屬、鏈球菌屬、放線菌屬、消化鏈球菌屬、丙酸桿菌等占主導[24]。同時，可能由于冠部封閉不嚴密，有利于兼性厭氧細菌的生長而形成新的根管感染。

2 根尖外優(yōu)勢菌的檢出

根尖外感染存在多種菌群，甚至形成根尖外生物膜，而根管治療無法控制根尖外生物膜，這可能是RAP根尖外感染持續(xù)的重要原因之一。

2.1 樣本獲取

獲取根尖外感染樣本的方法絕大多數以術中無菌垂直截取根尖3 mm為主。Ping等[16]將根尖樣品低溫研磨并從中提取DNA，以期完整地采集根尖周炎牙根管內和根管外的菌群。Signoretti等[25]用刮匙刮除部分根周組織后發(fā)現：根尖病變中，G+菌存活率最高。Pereira等[26]則結合截根和刮取組織兩種方法，結果發(fā)現：在根端和根尖周標本中以具核梭桿菌、害肺桿菌和福賽斯坦納菌最為常見。

就目前研究來看，同時采集根尖及根尖周樣本可能使研究結果更為完善。

2.2 檢測方法

根尖微生物的檢測手段亦分為細菌培養(yǎng)法與非培養(yǎng)方法。近十年來，對根尖外感染的研究采用多種手段聯合檢測。因為根管外生物膜的存在，研究者們還常用Brown&Brenn染色觀察生物膜的組織形態(tài)與組成。Signoretti等[25]僅用細菌培養(yǎng)法觀察發(fā)現：根尖病變中G+菌存活率最高；秦彥濤等[27]結合此法、細菌培養(yǎng)和16SrDNA克隆技術檢測到放線菌屬、丙酸菌屬；Wang等[28]結合此法與PCR在23例根尖標本中檢出的菌屬與秦彥濤等[27]發(fā)現的相同。

Zhang等[29]將RAP根尖樣本分為根外生物膜組與根尖周病變組，用16SrRNA基因克隆測序，結果發(fā)現：細菌數量最多的是厚壁菌門。在根外生物膜組中單獨發(fā)現了鏈球菌等10種菌。在根尖周病變中單獨檢出了變形桿菌、檸檬酸桿菌和微小單胞菌。周焱等[30]通過16SrDNA克隆文庫法檢測出的細菌大部分集中在厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和未培養(yǎng)菌，其中具核梭桿菌檢出率最高。周耀等[31]用PCR-DGGE檢測技術得到了放線菌屬與丙酸菌屬。Ping等[16]還采用了焦磷酸測序法。

2.3 優(yōu)勢菌

根外感染細菌通常以附著在根表面的生物膜形式存在，也可以以菌落和/或浮游細菌細胞的形式存在[32]。Signoretti等[25]發(fā)現：RAP患牙的根尖周微生物種類繁多，主要是G+菌，還有G-專性厭氧菌或兼性厭氧菌。G+菌細胞壁強健的結構成分使其在極端條件下表現出快速適應性，從而成為根管治療后疾病的潛在致病因素。優(yōu)勢菌屬包括放線菌屬、丙酸菌屬、梭桿菌屬、假單胞菌屬、卟啉單胞菌屬、普雷沃菌屬和鏈球菌屬。尤其是放線菌屬、丙酸菌屬有菌毛結構擅于聚集黏附，能夠清除營養(yǎng)物質并抵御宿主免疫機制，難以通過治療去除根外殘余。除了內毒素、蛋白酶等常規(guī)因素誘導與維持炎癥反應、誘導免疫反應等，部分根外優(yōu)勢菌形成的生物膜也是致病因子之一。值得注意的是，研究一般將有竇道的根尖周炎患者排除在外，因為竇道構成了根尖周病變與口腔之間的通道，改變了根尖周環(huán)境和局部微生物分布[33]。

于PubMed與各中文數據庫中搜尋近十年關于RAP根管內與根尖外微生物檢測的期刊文章、文獻綜述和研究文章，選取富有代表性的內容列入表1。

表1 RAP根管內和根尖外檢出的微生物對比Tab 1 Comparison of the predominant microbial flora detected in and outside of the root canal of RAP

3 RAP根管內及根尖外感染菌群的來源

規(guī)范的根管治療能促進根管內細菌的清除，改變了菌群的組成，在治療后營養(yǎng)缺乏的根管環(huán)境中，只有部分細菌能夠存活，它們或對根管藥物產生耐藥性，或治療無法觸及，或形成生物膜以適應惡劣環(huán)境。RAP根管內細菌區(qū)系與原發(fā)性根管內感染基本不同，且其中細菌的多樣性與含量均更少。

RAP感染可能是多種因素引起的，雖然某些細菌的存在似乎很明確，但感染的真正來源仍未確定。目前認為根尖部封閉不嚴、冠方封閉體的缺失和根尖部微生物殘留是引起RAP的主要原因[23]。

其實很難區(qū)分導致繼發(fā)感染的細菌是原發(fā)感染遺留下來的細菌，還是新引入的細菌。由于根管系統(tǒng)的解剖結構限制，難以獲取有代表性的樣本。這在癥狀緩解期的患者中更為明顯，因為在根管中可接觸到的細菌數量很低，在去除根管充填物的過程中，許多細菌可能會丟失。結果樣本數量會減少，可能會低估某些特定菌種的流行[14]。

同時，并不是所有殘存細菌都會導致疾病持續(xù)存在，約68%根管內有殘存細菌的患牙根管充填封閉后仍能愈合[34]。殘留的細菌也必須存在于根尖孔附近才能持續(xù)誘導根尖周炎。入侵根尖周組織的細菌通常被免疫反應清除，然而一些物種如放線菌能依靠黏附機制逃避宿主免疫細胞的吞噬[35]。

相比之下，根尖外優(yōu)勢菌群中G+菌，尤其是放線菌屬、丙酸菌屬，與G-的普雷沃氏菌屬等的檢出率格外高。而根管內優(yōu)勢菌群中球菌尤其是葡萄球菌屬、鏈球菌屬及單胞菌屬等更為多見。糞腸球菌等則在根管內外差異并不明顯。

要判斷根管內外菌群是否關聯，筆者提出2種假設，引起根尖外感染的細菌的生存和代謝要么依賴于根內細菌，要么獨立于根內細菌。在依賴的情況下，一旦通過根管治療解決了根內感染，根外感染也自動解決；相反，當根尖外感染是獨立的，即使根管治療成功后根外感染仍然存在[6]。

一些研究[33]發(fā)現：根內外生物膜相鄰，且兩者的特殊結構差異不明顯。這些觀察結果支持了根外生物膜通常是根內感染的延伸的假設。根尖孔與牙周膜的解剖學連接可使細菌入侵根外組織，當致病菌的能力達到一個閾值就可能誘發(fā)根尖周組織的炎癥[34]。在長期感染中，細菌可以在根面、或根管充填的無癥狀牙的根周病變中心存活，這些細菌具有隔離營養(yǎng)物的能力，可以克服宿主防御機制。

另一種看法是，這些根尖外細菌結構是否獨立于根內感染仍有待確定。鑒于這些細菌結構的高度組織性，有理由相信它們可能不會受到根管治療的顯著影響[28]。因此，這些成熟的根外生物膜可能成為獨立的感染源。但這種看法的研究支撐很少。

此外，根外感染在有竇道的患牙中很常見，竇道長期存在可能成為根周和外部環(huán)境之間的通道，唾液中的礦物質和鹽由此進入根尖周組織改變微環(huán)境，也改變局部細菌的分布[33]。

4 小結

綜上所述，不同研究中菌群之間的差異可能是由多種因素綜合造成的，尤其是隨著分子技術日新月異，所檢測出的細菌種類與數量都有很大進展。雖然在RAP根管內外感染的眾多研究中發(fā)現了相似的優(yōu)勢菌，但兩者的聯系、差異與致病作用都有待進一步的證實。盡管根管治療的效果有較高的可預測性，但完全根除細菌仍不容易，不是所有的根尖周炎都能通過規(guī)范的根管治療解決。鑒于目前微生物研究的局限性，希望增進對細菌種類及特定菌種確切致病特性的認識，尋找更理想的材料、器械與技術手段以提高根管治療的成功率。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。