覃思文 廖立

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 成都 610041

牙髓炎是發(fā)生在牙髓組織內(nèi)的炎癥病變。牙髓腔是一個(gè)狹窄的空間，正常情況下只能通過狹小的根尖孔引流，發(fā)生炎癥病變的牙髓往往難以自行痊愈，常導(dǎo)致牙髓壞死。目前牙髓炎的主要治療手段為根管治療，該方法雖然可以很好地控制感染與消除疼痛，但根管治療是將病變牙髓組織去除，屬于不可逆的治療方法，無法恢復(fù)未成熟恒牙中受損牙髓的活力和促使其牙根成熟[1]。治療后會(huì)發(fā)生牙齒硬度減弱，必須通過牙冠修復(fù)來恢復(fù)牙齒的正常功能，難以滿足現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)的要求。目前臨床亟需尋求牙髓炎治療的全新技術(shù)。

再生醫(yī)學(xué)治療被認(rèn)為是解決這一難題的可行的新方向。再生醫(yī)學(xué)的基本原理是依靠生物正常生長時(shí)體內(nèi)組織分化的特性，通過人工方法對創(chuàng)傷組織進(jìn)行器官再生與功能重建，以達(dá)到修復(fù)損傷組織或重建器官功能的目的。再生醫(yī)學(xué)的核心策略是通過人體內(nèi)各種體細(xì)胞、干細(xì)胞或胚胎衍生細(xì)胞，分化出具有功能的細(xì)胞、組織或器官[2]。早在2005年就有學(xué)者基于干細(xì)胞移植的再生醫(yī)學(xué)方案對修復(fù)牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體展開探索[3]，提出了利用牙髓干細(xì)胞進(jìn)行牙髓再生的可能[4]，為牙髓炎的治療打開了一扇新的大門。

現(xiàn)階段牙髓再生仍面臨著種種難題，其中之一是根管的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)再生困難。牙髓再生在組織學(xué)上的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)在于牙髓充滿血管、神經(jīng)元形成以及牙本質(zhì)的沉淀[5]。其中牙髓血管快速重建是前提，組織內(nèi)擁有大量血管網(wǎng)對細(xì)胞的代謝和清除破碎細(xì)胞有著十分重要的作用。有學(xué)者[6]曾嘗試直接將牙髓干細(xì)胞植入牙髓腔，但由于宿主的血管生成過緩，每天生長長度僅有0.1μm，植入體因缺乏營養(yǎng)而未能存活。由此可見，牙髓再生的關(guān)鍵因素在于牙髓血管網(wǎng)絡(luò)的重建。對牙髓再生中血管網(wǎng)絡(luò)重建策略進(jìn)行研究，對探索牙髓再生及其臨床試驗(yàn)是十分必要的。

目前血管網(wǎng)絡(luò)形成主要依賴于兩個(gè)基本的策略：一是體內(nèi)原位血管生成，二是移植物預(yù)血管化。前者主要采用血管生成的思路，對殘留牙髓或根尖周組織中的血管施加刺激，使殘留血管重新構(gòu)建出豐富的牙髓血管網(wǎng)絡(luò)；后者主要采用血管形成的思路，在植入體中通過內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）或各類能夠分化成ECs的干細(xì)胞從無到有地分化出血管網(wǎng)絡(luò)，隨后植入于牙髓腔中。這兩者并不是相互孤立的，原位血管生成技術(shù)由于生長速度過緩等一系列問題，催生了移植物預(yù)血管化技術(shù)；而預(yù)血管化技術(shù)中血管網(wǎng)絡(luò)與根尖周組織血管快速的交通吻合，或是新生毛細(xì)血管在植入體中的血管生成，也需要有原位血管生成技術(shù)的參與。這要求研究血管網(wǎng)絡(luò)形成策略必須充分考量兩者之間的共通之處。本文就這兩個(gè)基本策略的機(jī)制、作用和影響因素等進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)和探討。

1 體內(nèi)原位血管生成基本原理

體內(nèi)原位血管生成是指通過各種因素刺激ECs從血管表面生成血管芽從而形成血管網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)，既往已大規(guī)模開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其機(jī)制研究地較為透徹。牙髓中血管生成的過程與全身其他組織中的過程大致相同，包含兩個(gè)步驟：ECs在血管壁上形成血管新生芽（angiogenic sprouts），微血管的異位生長而導(dǎo)致的微血管分裂[7]。

血管新生芽是一種由ECs分化而來的特殊結(jié)構(gòu)，包括了“尖端細(xì)胞”和“莖細(xì)胞”，其形成依賴于以下三個(gè)步驟：尖端細(xì)胞的選擇分化、新生芽的延伸、血管腔的形成與擴(kuò)張[8]。對于血管新生芽而言，其延伸主要是“尖端細(xì)胞”的收縮過程，而不是“莖細(xì)胞”的延伸[9]。血管腔形成的分子機(jī)制表現(xiàn)為依賴于ECs的細(xì)胞空化（cell hollowing）、線性空化（cord hollowing）、空泡形成（cavitation）以及質(zhì)膜凹化（plasma membrane invagination）過程，其中質(zhì)膜凹化被認(rèn)為是一種新的管腔形成方式[10]。微血管的異位生長為已有微血管在靠近相鄰微血管的位置上的異位發(fā)芽，而不是在其一端的繼續(xù)生長[7]。

對于牙髓組織而言，其所處環(huán)境的特殊性決定了影響牙髓原位血管生成的機(jī)制較其他組織有所差異。目前通過研究牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）與牙髓組織中ECs在血管生成中的作用，發(fā)現(xiàn)牙髓血管生成受到下列多種因素的影響。

1.1 氧含量的影響

氧含量是影響牙髓血管生成的一個(gè)重要因素。既往研究[11]認(rèn)為：缺氧能激活ECs糖酵解途徑產(chǎn)生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）直接激活增殖分裂以血管生成；但如今發(fā)現(xiàn)缺氧也可通過控制DPSCs的各種信號(hào)通路來影響。缺氧可以激活DPSCs中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路，使其線粒體產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的能力下降[12]。過高濃度的ROS會(huì)損傷組織，只有較低而適宜濃度的ROS才可促進(jìn)血管生成[13]。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)：缺氧促進(jìn)DPSCs生成缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）與相撲-特異性蛋白酶1（SUMO-specific protease 1，SENP1），后兩者又反過來促進(jìn)DPSCs向ECs分化而形成正反饋回路。牙髓腔相比于其他組織屬低氧環(huán)境，這要求牙髓原位血管生成技術(shù)必須充分考量缺氧這一刺激因素，而原屬于牙髓腔的DPSCs在缺氧條件下的強(qiáng)血管生成能力會(huì)有所幫助。

1.2 炎癥反應(yīng)

炎癥可增加細(xì)胞促血管生成信號(hào)因子的分泌。Gnanasegaran等[15]發(fā)現(xiàn)：牙髓中炎癥可致DPSCs的基因表達(dá)發(fā)生改變，使其表現(xiàn)出向肝細(xì)胞分化的趨勢，可通過肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/C-met途徑參與到血管生成當(dāng)中。炎癥中牙髓組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）-9、MMP-14的表達(dá)量明顯增高[16-17]，這些信號(hào)因子影響著血管生成。

如何提高細(xì)胞在炎癥中的生存能力也是一個(gè)需要考慮的重點(diǎn)。Bindal等[18]還研究了人血小板裂解液（human platelet lysate，HPL）對DPSCs的影響，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的HPL可以提高DPSCs在炎癥環(huán)境下的生存能力與血管生成活性。此外，信號(hào)分子如HGF可以消除缺血組織的炎癥和纖維化[19]，有利于延緩缺血組織的壞死以便于及時(shí)血管生成。

炎癥的急慢性期均會(huì)對血管生成施加效應(yīng)。急性炎癥期會(huì)提高血管滲透性，使血小板和免疫細(xì)胞到達(dá)附近。它們負(fù)責(zé)恢復(fù)正常的組織結(jié)構(gòu)，為血管再生提供環(huán)境基礎(chǔ)；而慢性炎癥期這些細(xì)胞又分泌大量細(xì)胞因子維持著炎癥反應(yīng)，并且如上述闡述的機(jī)制進(jìn)行血管生成[20]。

1.3 信號(hào)因子的作用

無論是牙髓組織或是其他組織，ECs所受到的信號(hào)因子調(diào)控血管生成機(jī)制是相同的，可通過直接刺激、間接刺激或是反向抑制來調(diào)控血管生成。但牙髓組織中的細(xì)胞會(huì)以其特有的信號(hào)通路來調(diào)控這些信號(hào)因子的分泌，需要在牙髓血管重建策略中單獨(dú)考量。

刺激信號(hào)的研究最為透徹。能直接影響血管生成的信號(hào)因子中最重要的是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），它可由DPSCs通過腎上腺素B2（EphrinB2）/腎上腺素B4（EphB4）、人信號(hào)素4D（Semaphorin 4D，Sema4D）/叢狀蛋白B1（PlexinB1）等信號(hào)途徑分泌[21-22]。明膠酶（MMP-2和MMP-9）通過成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌[23]，通過切割細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)血管生成[24]。HGF能促進(jìn)ECs的有絲分裂[19]，其產(chǎn)生機(jī)制如炎癥部分所述。

能通過調(diào)控其他信號(hào)因子或細(xì)胞來間接影響血管生成的信號(hào)因子也起到了十分重要的作用。如成纖維細(xì)胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）能夠刺激ECs產(chǎn)生MMPs和VEGF[25]，同時(shí)能誘導(dǎo)牙祖細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化[26]。G補(bǔ)綴FHA域血管生成因子1（angiogenic factor with G and FHA domains 1，AGGF1）通過 核 因 子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路抑制炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)牙髓細(xì)胞（dental pulp cells，DPCs）的血管生成[27]。MMPs中MMP-3可以釋放位于細(xì)胞外基質(zhì)/基底膜中的VEGF[28]，VEGF是人牙髓成纖維細(xì)胞（human dental pulp fibroblasts，HDPFs）通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生的[29]。此外，抑制信號(hào)的作用不可忽略。對于MMPs組織抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）而言，處于牙髓炎狀態(tài)時(shí)的DPCs能夠分泌微小RNA（micro RNA，miRNA）-21，從而調(diào)節(jié)TIMP3與凝膠酶的相對水平[30-31]。同時(shí)，炎癥時(shí)高濃度的ROS也屬于抑制信號(hào)[13]，需要在血管生成過程中控制其生成。

需要注意的是，這些信號(hào)因子的直接或間接作用以及正向或反向作用均不是絕對的，在血管生成的不同階段、信號(hào)因子的數(shù)量以及靶細(xì)胞的不同均會(huì)影響其作用效果。對于這一復(fù)雜的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)行大量的研究。

1.4 細(xì)胞外囊泡的影響

相比于傳統(tǒng)的激素或小分子物質(zhì)所構(gòu)成的信號(hào)因子，細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）作為一種新興的信號(hào)傳遞介質(zhì)，其在血管生成中的作用逐漸被揭示。EVs是一種囊性的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，含有多種核酸和表面受體。EVs在多種組織中的血管生成能力均得到了驗(yàn)證[32]，可以認(rèn)為EVs在牙髓組織中也參與了血管生成。

一般來說，受損組織或血運(yùn)豐富組織干細(xì)胞來源的EVs具有較強(qiáng)的血管生成能力。Zhou等[33]發(fā)現(xiàn)：相比于牙周健康牙，從牙周受損牙中提取的DPSCs分泌的EVs有著更強(qiáng)的血管再生能力。來源于脂肪衍生干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的EVs通過激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT）和絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，ERK）信號(hào)通路進(jìn)行血管生成[34]。這些EVs中常攜帶有miRNA，血管生成會(huì)受其影響。如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中出現(xiàn)有一種含有miRNA的EVs，它能夠有效地促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的血管生成[35]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）也可以分泌富含有miRNA-210的EVs來改善梗死心臟中的血流狀態(tài)[36]。此外，目前EVs還作為口腔康復(fù)中無細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)的重要組成部分[37]，將在后續(xù)內(nèi)容（2.2.1部分）具體闡述。

2 移植物預(yù)血管化技術(shù)

體內(nèi)原位血管生成雖然在體外或體內(nèi)其他組織的實(shí)驗(yàn)中取得了較大的突破，但是在牙髓中的臨床前實(shí)驗(yàn)面臨著諸多困難：因?yàn)楦饪椎莫M小與根管的狹長形態(tài)，體內(nèi)血管難以長入植入的牙髓中，導(dǎo)致植入牙髓缺血壞死；而且體內(nèi)原位血管生成是一段漫長的過程[6]，在患者長期的治療過程中必須保證足夠的細(xì)胞因子與適宜的理化因素作用于植入牙髓中，目前的技術(shù)條件尚難以實(shí)現(xiàn)；此外，糖尿病等多種疾病會(huì)導(dǎo)致血管病變，也不利于體內(nèi)原位血管生成技術(shù)的開展。因此，可利用移植物預(yù)血管化技術(shù)進(jìn)行牙髓炎的治療，以減少患者的不適感，并利于工業(yè)化快速生產(chǎn)，從而符合當(dāng)代口腔醫(yī)學(xué)的要求。

移植物預(yù)血管化技術(shù)是指采用血管形成的思路，將原位組織或非原位組織的細(xì)胞在體外支架系統(tǒng)中培養(yǎng)出血管網(wǎng)絡(luò)后植入體內(nèi)。相比于傳統(tǒng)的原位血管生成策略，預(yù)血管化技術(shù)有著臨床操作快捷，容易大規(guī)模生產(chǎn)，對患者影響較輕等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上有著較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.1 預(yù)血管化技術(shù)的細(xì)胞來源

2.1.1 ECs 直接使用ECs用于血管生成是最簡便的方法。目前ECs主要來源為臍靜脈，通過酶消化可以從臍靜脈中獲取一定數(shù)量的ECs。此外，脂肪組織中也含有較豐富的微血管結(jié)構(gòu)，通過消化等方式，可以從吸脂手術(shù)獲得的脂肪組織中得到含有ECs的基質(zhì)碎片。但是，無論是通過臍靜脈還是脂肪組織的方式，從中獲取的ECs數(shù)量均較少，獲取過程較為困難，且在體外不能長期擴(kuò)增傳代，難以在體外大規(guī)模應(yīng)用。除了直接通過DPSCs分化形成ECs外，利用體內(nèi)其他更易獲取或具有更強(qiáng)擴(kuò)增能力的干細(xì)胞是較好的選擇。以下幾類細(xì)胞也表現(xiàn)出分化成ECs的能力。

2.1.2 MSCs 從骨髓中獲取的MSCs被認(rèn)為是用于大量擴(kuò)增出ECs的重要細(xì)胞來源。利用VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等細(xì)胞因子，現(xiàn)已能夠在體外誘導(dǎo)MSCs向ECs分化，從而較大量地?cái)U(kuò)增出ECs[38]，同時(shí)已證實(shí)了其用于預(yù)血管化技術(shù)的可行性[39]。但是獲取人自體骨髓這項(xiàng)技術(shù)難度較大，整項(xiàng)技術(shù)的成本較高，限制了其臨床應(yīng)用。

2.1.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs） 臍帶內(nèi)細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的大量應(yīng)用證實(shí)：UC-MSCs具有分化成ECs的能力，能夠用于血管生成。Liu等[40]將UCMSCs植入于缺血性心臟病模型豬中，發(fā)現(xiàn)有部分UC-MSCs轉(zhuǎn)變?yōu)镋Cs。Arutyunyan等[41]發(fā)現(xiàn)：UCMSCs能在補(bǔ)充有VEGF-A-165的EA.hy926細(xì)胞條件培養(yǎng)基（培育EA.hy926細(xì)胞72 h后的培養(yǎng)基）中，表現(xiàn)出CD31內(nèi)皮細(xì)胞表型。但目前看來，UC-MSCs轉(zhuǎn)化成ECs的數(shù)量較少，能否在人工誘導(dǎo)下大量分化成ECs仍留有爭議。目前臨床應(yīng)用僅停留于將其與ECs混合植入凝膠支架[42-43]，而人工誘導(dǎo)其大量分化為ECs的方法仍待研究。

2.1.4 脂肪基質(zhì)血管組分（stromal vascular fraction，SVF）和ADSCs 脂肪組織在人體內(nèi)易于提取，同時(shí)其中有著大量具有血管生成能力的細(xì)胞，可能是預(yù)血管化技術(shù)潛在的細(xì)胞來源。SVF包括有ECs以及ADSCs、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、周細(xì)胞等細(xì)胞[44]，可以直接應(yīng)用于血管再生，并已經(jīng)在心肌、脊髓、皮膚等組織的血管再生中得到應(yīng)用。已有實(shí)驗(yàn)[45]證實(shí)：植入小鼠體內(nèi)裝有SVF的凝膠支架表現(xiàn)出大量血管生成，體現(xiàn)了SVF用于預(yù)血管化技術(shù)的可行性。

此外，脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞也具有向ECs分化的潛力。在通常的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，ADSCs一般能夠被誘導(dǎo)分化成ECs。培養(yǎng)基的構(gòu)建可以在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中加入VEGF、bFGF、IGF、抗壞血酸2-磷酸鹽（ascorbic acid 2-phosphat，A2P）、EGF與氫化可的松[46]，也可以加入如人類皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞1（human dermal microvascular endothelial cells-1，HMEC-1）等ECs所產(chǎn)生的分泌物[47]。但Volz等[46]建議去除培養(yǎng)基中的EGF和氫化可的松，認(rèn)為它們會(huì)導(dǎo)致ADSCs的脫分化，可能會(huì)對ADSCs分化形成ECs產(chǎn)生不利影響。除了自身分化成ECs外，ADSCs能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞微管基因，從而促進(jìn)ECs的血管生成[48]。

Jin等[49]認(rèn)為ADSCs的功能與DPSCs高度相似，并認(rèn)為使用ADSCs用于代替DPSCs的血管再生功能是可行的。他們發(fā)現(xiàn)DPSCs和ADSCs均能夠表達(dá)MSCs相關(guān)的表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD105，都具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管生成活性，可以用于預(yù)血管化技術(shù)中。

2.1.5 胎盤衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PlaMSCs） 胎盤是一個(gè)高度血管化的結(jié)構(gòu)，針對PlaMSCs用于血管生成的研究[50]已有開展。在VEGF作用下，PlaMSCs能夠表達(dá)內(nèi)皮特異性標(biāo)記馮·威利布蘭德因子（endothelial-specific marker von Willebrand factor，vWF），提示分化成ECs[51]?，F(xiàn)已證實(shí)PlaMSCs不僅能進(jìn)行體內(nèi)血管生成，也具有體外血管生成的能力[52]。相比于MSCs，PlaMSCs更加容易獲取，因?yàn)樘ケP通常作為廢棄物被丟棄，對患者或胎兒無傷害，但獲取時(shí)間與個(gè)體性別受限，同樣可作為預(yù)血管化技術(shù)的潛在選擇。

2.2 預(yù)血管化系統(tǒng)的構(gòu)建

牙髓中預(yù)血管化系統(tǒng)的構(gòu)建通常需要滿足以下要求：構(gòu)建豐富的血管網(wǎng)絡(luò)，具有多孔結(jié)構(gòu)的支架系統(tǒng)，建立適應(yīng)的再生微環(huán)境，便于DPSCs的存活以及牙髓組織的形成。

2.2.1 構(gòu)建豐富的血管網(wǎng)絡(luò) 體外血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建需要兩個(gè)條件：一是需要有ECs以生成血管腔，二是適宜的周圍環(huán)境激活ECs。當(dāng)把ECs或細(xì)胞組分植入預(yù)血管化系統(tǒng)后，需要進(jìn)一步建立適宜的微環(huán)境，但由于利用其他細(xì)胞來調(diào)控環(huán)境過于復(fù)雜，因此目前主要利用包括有特定信號(hào)因子的無細(xì)胞治療劑與構(gòu)建適宜的理化環(huán)境來誘導(dǎo)血管再生。

用于促進(jìn)血管生成的無細(xì)胞治療劑通常分為組織提取物以及人工合成營養(yǎng)液兩類。組織提取物中通常含有大量的信號(hào)因子。He等[53]和Yu等[54]分別以不同的方法提取出了人類脂肪組織液體提取物，證實(shí)其中含有大量bFGF、EGF、TGF-1、VEGF、HGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）等促血管生成信號(hào)因子，被認(rèn)為是一種優(yōu)良的血管再生治療劑。此外，多項(xiàng)研究[55-57]也探討了MSCs、人類脫落乳牙干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）分泌物對血管生成的作用，但人脂肪組織與人骨髓、臍帶及脫落乳牙組織相比，從中獲得自體細(xì)胞的量更大，減少了異體移植的風(fēng)險(xiǎn)，更符合現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)的要求。

EVs可能是組織提取物中的重要成分，有學(xué)者考慮單獨(dú)使用EVs的方案。大量獲取EVs的方法主要是通過收集組織、MSCs、ADSCs及其他細(xì)胞的培養(yǎng)液[58]，通過超速離心等方式來獲得。從脂肪組織中衍生的EVs相比于骨髓組織，其促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）形成血管的能力更強(qiáng)[59]。在EVs的臨床前應(yīng)用研究中，Zhou等[60]設(shè)計(jì)了一種多肽納米纖維水凝膠，在MMP-2存在時(shí)持續(xù)釋放MSCEVs，并證實(shí)該凝膠能改善微血管ECs的再生。Zhang等[61]將纖維蛋白凝膠與從DPSCs中提取出的EVs混合，獲得了一種能夠快速血管化的復(fù)合材料。

人工合成營養(yǎng)液也被證實(shí)在體外血管生成中有著巨大作用。Seang等[62]使用Iloprost（一種環(huán)前列腺素的替代物）成功讓牙髓組織切片在無血清條件下存活接近3 d，并產(chǎn)生出新生血管。Ibrahim等[63]發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵初榨椰子油通過促進(jìn)HUVEC、視網(wǎng)膜結(jié)節(jié)細(xì)胞5、成纖維細(xì)胞18等細(xì)胞的增殖，顯著刺激了體外實(shí)驗(yàn)中的血管生成。此外也可以對EVs進(jìn)行人工改造，如利用阿托伐他汀處理MSCs，改造后的EVs可以通過AKT/內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路增強(qiáng)ECs形成血管的功能[64]。

2.2.2 具有多孔結(jié)構(gòu)的支架系統(tǒng) 正常人的牙髓組織主要是由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，這一疏松結(jié)構(gòu)有利于各種纖維、神經(jīng)、血管及淋巴管的長入。正如許多血管支架系統(tǒng)[65-66]所提示的，支架的多孔結(jié)構(gòu)是影響血管生成的一個(gè)重要因素，而水凝膠支架被認(rèn)為是牙髓再生支架的首選。

水凝膠是一類具有親水性的凝膠的統(tǒng)稱，具有較好的生物降解性，在牙髓恢復(fù)正常功能后其可被人體降解，是目前用于牙髓植入支架系統(tǒng)中十分有前景的選擇。水凝膠分為天然凝膠與人工合成凝膠兩類。天然凝膠采用體內(nèi)成分構(gòu)建，主要包括纖維素、膠原、明膠、透明質(zhì)酸以及瓊脂糖凝膠[67]，其中如骨細(xì)胞外基質(zhì)（bone extracellular matrix，bECM）支架與牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體外基質(zhì)支架具有足夠強(qiáng)的促DPSCs分化能力[65,68]，明膠支架也可人工封裝如VEGF等信號(hào)因子以增強(qiáng)血管生成[69]。人工合成凝膠既可以是完全人工合成的，也可以是通過改造天然凝膠獲得的。Ardeshirylajimi等[70]總結(jié)了多種人工合成水凝膠支架，這些凝膠支架可用于增強(qiáng)細(xì)胞增殖、骨源分化、預(yù)防殺菌以及牙髓再生。對于改造天然凝膠，硼改性醋酸纖維素/氧化普魯蘭多糖/明膠凝膠支架實(shí)現(xiàn)了DPSCs的體外牙髓再生[66]。

水凝膠具有相互交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，富含組織再生所需的孔隙。大孔徑和高孔隙率的支架可以刺激大量膠原蛋白、血管和深部組織的生成[71]，但孔隙的大小不是越大越好。Qazi等[72]認(rèn)為：302μm左右的孔徑刺激MSCs血管生成旁分泌的能力最高，這就對制造孔隙提出了技術(shù)要求。低溫處理是一種常見的產(chǎn)生孔隙的方法，但是此方法難以控制其孔徑大小。Dehli等[73]設(shè)計(jì)了一種不使用低溫、有毒化學(xué)品和有機(jī)溶劑處理的水凝膠支架，并且可以自行調(diào)控孔隙尺寸。另外，隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，用于牙髓或基于DPSCs再生醫(yī)學(xué)的3D打印技術(shù)凝膠支架也有眾多學(xué)者開展[74-78]，這為孔徑大小控制提供了更多可選方案。

除水凝膠外，諸如納米粒子纖維技術(shù)、納米光刻技術(shù)、重組蛋白技術(shù)等新型生物材料也已經(jīng)開發(fā)出來[79]。其中如涂有三氧化物多聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）的聚（L-丙交酯）[poly(L-lactide)，PLLA]納米纖維增強(qiáng)了DPSCs的牙源性分化[80]，石墨烯-聚丙酮混合納米纖維實(shí)現(xiàn)了DPSCs的神經(jīng)分化[81]。但基于上述材料的牙髓植入臨床前應(yīng)用仍待研究。

2.2.3 建立適宜的牙髓再生微環(huán)境 由于所構(gòu)建的預(yù)血管化系統(tǒng)將植入牙髓腔中并最終再生成人工牙髓，因此DPSCs必須能夠在其中存活并最終分化成牙髓組織。這就要求預(yù)血管化系統(tǒng)有能促進(jìn)DPSCs分化的要素以及對DPSCs無細(xì)胞毒性。DPSCs能夠分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等細(xì)胞，每種分化方向所需要的信號(hào)因子均不同。對于牙髓組織再生，自然希望其向著成骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。Ferro等[82]的研究總結(jié)了上述分化方向所需要的信號(hào)因子，具體見表1。另外，Duncan等[83]的研究探討了體外血管再生實(shí)驗(yàn)中生長因子（growth factor，GF）的作用，認(rèn)為GF的摻入有必要但現(xiàn)階段技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)。而有關(guān)對DPSCs細(xì)胞毒性的探究仍需大量的臨床及臨床前實(shí)驗(yàn)，期待后續(xù)的研究。

表1 DPSCs不同分化方向所需信號(hào)因子Tab 1 Signal factors required for the differentiation direction of DPSCs

2.3 牙髓血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的臨床應(yīng)用

血管生成的臨床應(yīng)用較少，目前多停留在臨床前實(shí)驗(yàn)階段。多項(xiàng)研究[65,84-85]均采用了細(xì)胞外基質(zhì)及其衍生物作為凝膠支架，加入DPSCs/ADSCs/人骨髓中層間充質(zhì)干細(xì)胞與細(xì)胞因子，植入人離體牙根管中，隨后接種于動(dòng)物體內(nèi)，均獲得了較好的牙髓再生情況。目前基于DPSCs/SVF的牙髓血管再生思路被認(rèn)為是從安全性與效果上都符合要求的方法。DPSCs起源于牙髓組織中，分化成牙髓組織的可行性高；SVF攜帶有大量信號(hào)因子，可從自體器官中大量獲取，具有更好的安全性，其中的ADSCs具有強(qiáng)血管生成能力。此外，Lin等[86]的研究證實(shí)：DPSCs可以顯著減少受損牙周組織的再生周期，提示基于DPSCs的牙髓再生臨床應(yīng)用可能會(huì)獲得比其他細(xì)胞更好的療效。而采用移植物預(yù)血管化技術(shù)的實(shí)驗(yàn)則較少，Athirasala等[87]設(shè)計(jì)了一種帶有中央通道的水凝膠支架，利用成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)得到的新生血管會(huì)從通道處向外發(fā)散。

盡管目前的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但是正如Huang等[84]所擔(dān)憂的，將凝膠支架植入根管中這一過程，正是該治療技術(shù)中最為困難的一點(diǎn)。每個(gè)人根管的形狀、大小、結(jié)構(gòu)均不固定，易碎的凝膠支架植入過程中需要高分辨率CT進(jìn)行輔助，從而使得這項(xiàng)技術(shù)無法大規(guī)模開展。此外，植入框架屬于外來異物，血管支架植入會(huì)不可避免地引發(fā)不良炎癥反應(yīng)[88]。迄今尚未發(fā)現(xiàn)有培養(yǎng)出完整血管網(wǎng)絡(luò)支架的牙髓預(yù)血管化實(shí)驗(yàn)，由此推測其困境和上述根管植入技術(shù)不成熟有關(guān)，期待后續(xù)研究。

3 結(jié)論與展望

自從Nakashima等[3]于2005年提出通過再生醫(yī)學(xué)治療牙髓炎的方法后，眾多學(xué)者對此問題進(jìn)行了不斷地研究，提出了各種各樣的再生修復(fù)方案。隨著研究的深入，牙髓血供不足的問題逐漸浮現(xiàn)，學(xué)者們提出了體內(nèi)原位血管生成和預(yù)血管化系統(tǒng)植入兩種方案，探究出兩者的機(jī)制與影響因素，并逐步開展各項(xiàng)試驗(yàn)，為牙髓再生的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

原位血管生成技術(shù)雖然治療療程長，受體內(nèi)環(huán)境影響大，需要考慮其他細(xì)胞的影響，臨床實(shí)驗(yàn)成功率相對較低，但在新生血管網(wǎng)絡(luò)和殘留組織血管網(wǎng)絡(luò)之間起到了橋梁作用，在血管生成策略中仍需重點(diǎn)看待。預(yù)血管化技術(shù)存在可縮短治療療程，可采用其他細(xì)胞以減少成本或減少不良反應(yīng)，可采用無細(xì)胞培養(yǎng)液以減少不良影響，利于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。基于DPSCs、SVF/ADSCs、水凝膠血管支架的血管再生策略相比于其他策略，具有細(xì)胞獲取來源廣、組織相容性好、血管生成能力強(qiáng)、血管再生機(jī)制較為透徹以及凝膠支架孔隙構(gòu)建簡單等優(yōu)點(diǎn)，可為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前對于牙髓再生的臨床實(shí)驗(yàn)依舊不足，難以降低支架植入根管難度與解決不良炎癥反應(yīng)的影響，多停留在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上，且少有預(yù)血管化技術(shù)的臨床應(yīng)用研究。此外，對于細(xì)胞移植可能帶來的細(xì)胞毒性和安全性問題，雖然在大多數(shù)既往研究中尚未發(fā)現(xiàn)明確的不良反應(yīng)，但需要注意的一點(diǎn)是，目前推薦使用自體細(xì)胞來進(jìn)行預(yù)血管化技術(shù)，因?yàn)楫愺w細(xì)胞可能會(huì)引起免疫反應(yīng)等異常反應(yīng)，而且體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得的細(xì)胞需要經(jīng)過嚴(yán)格的安全性和有效性檢測才能應(yīng)用于臨床，所以仍需對此項(xiàng)技術(shù)保持謹(jǐn)慎態(tài)度。希望今后能夠盡早進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。

綜上，基于DPSCs、SVF/ADSCs、水凝膠三者結(jié)合構(gòu)建出的移植物預(yù)血管化系統(tǒng)可能是未來的重點(diǎn)研究方向，但對于如何降低植入難度、系統(tǒng)血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建情況、組織相容性、長期觀察下的各種理化和毒理性質(zhì)仍需進(jìn)行大量研究。在該領(lǐng)域進(jìn)行的深入探索和臨床研究，有望為患者的牙髓炎治療提供新的方向。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。