李曉民 梁韋巍 韓志強 李君 范崇帥 劉志香

皮膚鱗狀細胞癌來源于皮膚的鱗狀上皮組織，是好發(fā)于老年人的常見皮膚惡性腫瘤之一[1]。至今關于皮膚鱗狀細胞癌的病因和發(fā)病機制尚未明確，可能與化學致癌劑、慢性炎癥等有關。了解皮膚鱗癌的發(fā)病機制，對于其診療具有重要的意義。PI3K/Akt信號通路是參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲等過程的重要通路，其激活可促進腫瘤細胞生長[2]。

葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin，GSP)是從葡萄籽中提取的一類活性物質，具有抗氧化、抗炎等廣泛生物活性[3-4]。目前多種中醫(yī)藥成分已被證實具有廣泛的抗腫瘤活性[5]，GSP作為一種營養(yǎng)補劑已被廣泛使用，對乳腺癌、結腸癌、皮膚癌等具有良好的抗腫瘤作用。雖然已有報道GSP能誘導多種惡性腫瘤凋亡，但對人皮膚鱗狀細胞癌的凋亡機制尚不明確。本實驗使用體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞觀察GSP誘導細胞凋亡的作用，并從PI3K/Akt信號通路探討其對人皮膚鱗狀細胞癌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人皮膚鱗狀細胞癌細胞株(A431細胞，編號：KCB200651YJ)購自中國科學院細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37°C、5% CO2條件下的二氧化碳孵箱中常規(guī)培養(yǎng)人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞[6]。具體操作如下：使用滅菌的PBS緩沖液清洗細胞3遍，加入0.25%的胰酶消化液消化細胞，顯微鏡下觀察細胞變圓后加2 mL培養(yǎng)基終止消化，轉移到15 mL離心管中離心，棄掉上清液加新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，傳代培養(yǎng)。

1.3 實驗試劑

GSP(貨號: 29106-49-8)購自美國Sigma公司。MTT試劑(貨號：88417)購自美國Sigma公司。兔抗p-PI3K(貨號：bs-5570R)、PI3K(貨號：bs-6417R)、p-Akt(貨號：bs-2849R)、Akt(貨號：bs-0115R)、cleaved caspase-3抗體(貨號：bs-0087R)購自北京博奧森生物技術有限公司。鼠抗GAPDH抗體(貨號：KC-5G4)購自上?？党缮锕こ逃邢薰尽？雇肐Rdye800(貨號：C50331-05)及抗鼠IRdye680(貨號：C50520-02)熒光二抗購自美國LI-COR公司。

1.4 實驗儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司，型號：HF90)；多功能酶標儀(美國分子儀器有限公司，型號：Spectra Max M5)；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LICOR公司，型號：Odyssey)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社，型號：IX71)。

1.5 MTT法檢測人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞存活率

使用0.25%胰酶消化后，將A431細胞接種于96孔板，每孔為1×104個細胞，于37℃、5% CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入不同濃度的GSP(5、10、20、40、80 μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時。加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT工作液，置于37℃孵箱中繼續(xù)孵育4小時，棄掉培養(yǎng)板孔中的液體，加DMSO 100 μL小心震蕩使結晶完全溶解后，使用酶標儀于570 nm處檢測各組細胞的光吸光度值。GSP組采用滅菌的PBS溶解，加無血清的DMEM培養(yǎng)液處理，正常對照組加等量的PBS。細胞的相對存活率=GSP組/正常對照組×100%。實驗重復3次。

1.6 蛋白免疫印跡(western blot)法檢測人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞PI3K/Akt信號通路和cleaved caspase-3蛋白表達

將A431細胞接種于6孔板，每孔加1 mL，每孔1×105個細胞，加入40、80 μg/mL的GSP處理48小時后，收集各組細胞提取蛋白。加適量細胞裂解液，置于冰上裂解30分鐘，12 000 r/min、4℃條件下離心30分鐘，提取總蛋白。采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。每組等量的蛋白質進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜，脫脂牛奶封閉，加孵育一抗(p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、cleaved caspase-3及GAPDH抗體，1∶500)，室溫孵育半小時，4℃冰箱過夜。棄去一抗，洗膜，加熒光二抗(1∶5000)孵育2小時，避光洗膜。采用Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)顯影分析。蛋白灰度值采用Quantity One軟件進行分析。目的蛋白表達水平=(目的蛋白條帶灰度值/GAPDH)/(對照組蛋白條帶灰度值/GAPDH)×100%。

1.7 觀察PI3K/Akt信號通路激活劑對A431細胞凋亡的影響

取對數生長期的A431細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞。正常對照組加入DMEM培養(yǎng)基，GSP組加入40 μg/mL的GSP處理，740 Y-P聯合用藥組加入PI3K激活劑 (50 μg/mL)和GSP(40 μg/mL)，SC-79聯合用藥組加入Akt激活劑SC-79(20 μmol/L)和GSP(40 μg/mL)，MTT法檢測細胞相對存活率的變化。實驗重復3次。

將A431細胞接種于6孔板后，每孔1×105個細胞。細胞隨機分為正常對照組、GSP組、740 Y-P聯合用藥組和SC-79聯合用藥組，處理同上。Western blot法檢測PI3K/Akt通路蛋白磷酸化表達，觀察PI3K/Akt通路蛋白磷酸化的變化。實驗重復6次。

1.8 數據處理

2 結果

2.1 GSP對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞存活率的影響

MTT結果顯示，不同濃度的GSP(5、10、20、40、80 μg/mL)作用不同時間(24、48、72小時)后，A431細胞的相對存活率隨著葡萄籽原花青素濃度的升高和處理時間的延長而降低，呈時間濃度依賴性。見表1。

表1 不同濃度GSP對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞存活率的影響

2.2 GSP對A431細胞cleaved caspase-3蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，A431細胞經葡萄籽原花青素(40、80 μg/ml)處理48小時，cleaved caspase 3蛋白表達明顯增加，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1、表2。

注：A 正常對照組；B GSP組(40 μg/mL)；C GSP組(80 μg/mL)。

表2 不同濃度GSP對A431細胞cleaved caspase-3蛋白表達的影響

2.3 GSP聯合PI3K/Akt通路激活劑對PI3K/Akt通路蛋白表達的影響

為進一步證實GSP是否通過PI3K/Akt通路誘導細胞凋亡，本實驗采用PI3K的激活劑740 Y-P及Akt的激活劑SC79與GSP共同處理干預A431細胞48小時后，Western blot法檢測p-PI3K和p-Akt的蛋白表達情況。結果顯示，與正常對照組相比，GSP組p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯下降(P<0.01)。與GSP組比較，740 Y-P聯合用藥組p-PI3K蛋白表達明顯上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與GSP組比較，SC79聯合用藥組p-Akt蛋白表達明顯上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表3。

注：A、D 正常對照組；B、E GSP組；C 740 Y-P聯合用藥組；F SC79聯合用藥組。

表3 葡萄籽原花青素聯合PI3K/Akt通路激活劑對各組PI3K/Akt通路蛋白表達的影響

采用PI3K的激活劑740 Y-P或Akt的激活劑SC79與GSP共同處理干預A431細胞48小時后，MTT法檢測細胞相對存活率的變化情況。與正常對照組相比較，GSP組細胞存活率顯著下降；與GSP組比較，740 Y-P聯合用藥組、SC79聯合用藥組細胞活性顯著上升，表明PI3K/Akt信號通路的激活劑能逆轉葡萄籽原花青素對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞的抑制作用。見表4。

表4 葡萄籽原花青素聯合PI3K/Akt通路激活劑對細胞相對存活率的影響

3 討論

皮膚鱗狀細胞癌是起源于表皮或附屬器角質形成細胞的常見皮膚非黑素惡性腫瘤，發(fā)病率高、轉移性強，晚期約5%的患者發(fā)生惡性轉移，已成為危險人類生命的重要疾病之一[7]。目前主要治療方法是手術治療[8]，尚缺乏針對人皮膚鱗狀細胞癌的有效靶向藥物，因而尋求一種能夠有效治療人皮膚鱗狀細胞癌的藥物具有重要的臨床意義。

GSP是一類藥理活性很強的天然多酚類物質，具有抗氧化、抗炎、保護心血管、清除自由基等作用。GSP可以通過抑制與活性氧相關信號蛋白的表達對抗氧化應激、減少炎癥因子的產生和抑制細胞凋亡。研究發(fā)現，GSP可誘導結腸癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌等細胞的凋亡[4,9-11]。葡萄果皮和種子提取物對A431細胞具有明顯的細胞毒作用，并能誘導細胞凋亡[12]。原花青素通過降低β-catenin抑制人黑色素瘤細胞增殖并誘導凋亡[13]。本研究采用MTT法檢測不同濃度、不同時間GSP對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞活力的影響，結果發(fā)現GSP能夠呈時間、濃度依賴性地抑制人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞的活力。進一步檢測GSP對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞cleaved caspase 3蛋白表達的影響，結果發(fā)現GSP顯著誘導人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞cleaved caspase 3蛋白表達上調。但是，GSP對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞活性抑制并誘導細胞凋亡的作用機制尚不清楚。

PI3K/Akt信號通路是細胞內的重要信號通路[14]，與腫瘤關系密切，通過促進細胞增殖、侵襲及抑制細胞凋亡等方式促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，已經在乳腺癌、肺癌等的研究中得到了證實。研究發(fā)現，在皮膚癌組織中Akt信號通路異?；罨?，并且該異?；罨男盘柵c癌組織的多種行為關系密切，包括細胞增殖、遷移、細胞凋亡以及血管生成轉化等。因而PI3K/Akt信號通路被作為研究皮膚癌的重要靶點。研究表明，原花青素通過調控PI3K/Akt途徑抑制結腸癌的增殖和侵襲[15]，促進喉癌TU686細胞自噬并抑制細胞增殖[16]。本實驗發(fā)現GSP可以顯著抑制A431細胞中PI3K/Akt信號蛋白磷酸化，上調細胞凋亡蛋白caspase 3的表達，提示GSP可能通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制皮膚鱗狀細胞癌的增殖。740-Y-P是PI3K的選擇性活化劑，SC79是Akt的選擇性活化劑，本實驗結果顯示，GSP聯合使用740-Y-P或SC79能夠逆轉對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞活力的抑制作用，進一步證實GSP可以通過PI3K/Akt信號通路抑制皮膚鱗癌的細胞生長，誘導細胞凋亡。

綜上所述，GSP可抑制皮膚鱗癌細胞A431細胞活力，誘導細胞凋亡，其機制可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路實現的。本研究為GSP用于抗人皮膚鱗狀細胞癌治療提供實驗依據。