肖舒文，胡永紅

(河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024)

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BA)是普遍存在于生物體內的一種代謝酶，對糖酵解和糖異生至關重要[1].在高等植物中，F(xiàn)BA還參與卡爾文循環(huán)，是調控光合作用速率的重要酶之一[2].本文中，筆者對FBA的分類進行簡要介紹，著重介紹了其在生物體內的功能及其在抗真菌和病原體中的應用等，旨在為今后深入研究FBA提供理論依據.

1 FBA的分類

FBA具有(β/α)8桶折疊結構，根據反應機理不同分為2類：Ⅰ類是已知的四聚體，主要存在于高等真核生物中，如動物、植物和藻類；Ⅱ類主要以同源二聚體的形式存在于細菌中[3].Ⅰ類FBA由賴氨酸殘基構成其活性位點，可與底物形成席夫堿中間產物，由于該結構受到硼氫化物的抑制，因此Ⅰ類FBA活性會受到硼氫化物抑制[4-6].Ⅰ類FBA的四聚體結構，由4個分子量約為40 kDa的亞基構成，且具有最大催化活性所需的酪氨酸殘基[7]，如圖1所示[8].根據免疫學、動力學性質不同[9]，Ⅰ類FBA可細分為3種特定類型，即A，B，C型，主要存在于脊椎動物不同組織中.A型主要存在于骨骼肌和血液紅細胞中，B型主要存在于小腸、肝、腎中，C型主要存在于平滑肌細胞和神經組織中[10]，這3種類型都由氨基酸組分不同的4個多肽鏈構成.Ⅱ類FBA發(fā)揮活性作用時需要一個2價金屬陽離子作為輔助因子，通常是Zn2+，Ca2+或Fe2+，其活性受到金屬離子螯合劑的競爭性抑制[11].Ⅱ類FBA的重要氨基酸和三維結構非常保守，具有使其形成二聚體的“二聚化手臂”，如圖2所示[12].根據其內部氨基酸序列的同源程度又將Ⅱ類FBA分成2類，即A型和B型，A型是鋅依賴性的，B型具有其他不同的2價金屬輔因子[1].

圖1 Ⅰ類FBA四聚體結構[8]Fig.1 The Tetramer Structure of Class I FBA

圖2 Ⅱ類FBA二聚體結構[12]Fig.2 The Dimer Structure of Class Ⅱ FBA

2 FBA的功能

2.1 參與生物體內的能量代謝

FBA是一種古老的、進化上保守的代謝酶[13].對于同時擁有FBA 2種類型的生物體來說，大多數(shù)只表達其中一種[7].在糖酵解和糖異生反應中，F(xiàn)BA催化底物果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate，F(xiàn)BP)裂解為3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde-3-phosphate，G3P)和磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)或反向的醛醇縮合反應，在此過程中FBA將C6分子分裂為C3分子，然后轉化為丙酮酸，最后合成生物體內的脂肪酸或氨基酸[14].卡爾文循環(huán)是光合作用中暗反應的一部分，是光合碳中最重要的一條途徑.FBA參與卡爾文循環(huán)中的第3個階段,即核酮糖-1,5-二磷酸(ribulose-1,5-biphosphte，RuBP)的再生.在比階段中，磷酸丙糖異構酶催化DHAP生成G3P，G3P再與DHAP在FBA催化下轉化為FBP，F(xiàn)BP又經過一系列的反應最終生成RuBP.因此，F(xiàn)BA在植物光合作用的暗反應階段起重要作用，可固定CO2，并將3C化合物轉化為6C化合物，同時，也是控制光合作用速率的重要酶之一[2].由此可見,FBA的主要功能在于參與生物體內的能量代謝，除此之外他還有一些“兼職”功能.

2.2 充當纖溶酶原結合蛋白

FBA基因所表達的蛋白是一種纖溶酶原(plasminogen,Plg)結合蛋白[15-17].有研究發(fā)現(xiàn)，副球孢子菌FBA存在于真菌表面并由真菌分泌，可激活宿主Plg形成纖溶酶，有利于病原體真菌擴散到宿主體內更深的組織[18].為驗證FBA此功能，將副球孢子菌FBA基因克隆到表達載體pGEX-4T-3中，并通過大腸桿菌表達獲得重組蛋白rFBA.Far-western blotting分析表明，該蛋白與Plg的結合呈劑量依賴性.將副球孢子菌Pb01株系在人纖溶酶原、纖溶酶原激活劑條件下培養(yǎng)，當培養(yǎng)基中加入rFBA抗體時，宿主的纖溶酶活性降低，推測rFBA抗體阻斷了真菌表面FBA與纖溶酶原的結合.進而得出結論，副球孢子菌FBA在真菌入侵宿主組織中發(fā)揮重要作用，增加了其在宿主組織中的傳播潛力.華支睪吸蟲(Clonorchissinensis)排泄分泌產物中存在多種蛋白混合物，在其侵染宿主時會結合宿主體內某些上皮細胞，使其產生毒性物質，從而導致宿主受到傷害[19].有研究報道，華支睪吸蟲可激活宿主的纖溶酶原形成纖溶酶，而纖溶酶負責纖維蛋白和細胞外基質的降解，可激活膠原酶釋放肽，使寄生蟲在宿主體內獲得營養(yǎng)[20].將華支睪吸蟲果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(CsFBA)開放閱讀框插入到pET30(a+)載體中，并將重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)表達，其重組CsFBA蛋白(rCsFBA)分子量約為45.0 kDa[21].酶聯(lián)免疫吸附試驗和配體印跡分析表明，rCsFBA及華支睪吸蟲總提取物和分泌產物中的天然CsFBA均能與人纖溶酶原結合.華支睪吸蟲在感染宿主時，通過其肌肉吸盤鉤在宿主膽管上皮，并不斷從血管中攝取血液用于供能.華支睪吸蟲分泌物中CsFBA可促進宿主體內纖維蛋白水解，消除宿主在止血過程中形成的纖維蛋白凝塊，以維持血液的正常流動.因此，華支睪吸蟲能夠從宿主組織中獲得足夠的營養(yǎng)，在宿主中成功地存活和定殖.

2.3 作為宿主細胞粘附的結合劑

在檢測牛分枝桿菌(Mycoplasmabovis)FBA作為黏附素的研究中，利用PCR技術擴增牛分枝桿菌FBA基因，將其克隆到原核表達載體pET28(a+)中，構建pET28(a+)-FBA質粒，并轉入大腸桿菌表達，純化獲得重組牛分枝桿菌FBA蛋白(rMbFBA).熒光顯微鏡顯示，用兔抗rMbFBA預處理可降低牛分枝桿菌與胚胎型牛肺細胞(embryonic bovine lung,EBL)的粘附.此外，粘附抑制試驗顯示，在用兔抗rMbFBA處理后，牛分枝桿菌對EBL細胞的感染率下降了34.4 %，表明FBA參與了細菌對EBL細胞的粘附[22].將腦膜炎球菌rFBA在非變性條件下表達和純化，得到的rFBA顯示出醛縮酶活性，證實純化后的酶處于天然構象.細胞分離實驗表明，腦膜炎球菌FBA既存在于細胞質，也存在于外膜.流式細胞術顯示，外膜的FBA可被特異性抗體識別.通過比較腦膜炎球菌野生型、缺乏FBA的突變株和互補突變株與人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial，HBME)之間的相關性和入侵能力，結果顯示，與野生型或互補型菌株相比，F(xiàn)BA突變株粘附HBME細胞單層膜的能力顯著降低.表明FBA是腦膜炎奈瑟菌黏附人體細胞所必需的[23].Chaves等[18]檢測了副球孢子菌rFBA及rFBA抗體在感染巨噬細胞過程中的作用，通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞能夠結合副球孢子菌的rFBA，此時rFBA表現(xiàn)為黏附素.將巨噬細胞用副球孢子菌rFBA孵育后，副球孢子菌對巨噬細胞的感染率降低79 %；將副球孢子菌孵育rFBA抗體時，感染率降低86 %，實驗結果表明，rFBA抗體的加入可阻斷FBA與巨噬細胞的結合，從而減少其與副球孢子菌之間的相互作用，說明FBA是參與真菌粘附、入侵和傳播的重要毒力因子.

2.4 作為轉錄調節(jié)因子

早期的轉錄組學研究顯示，F(xiàn)BA基因對于弗朗西塞拉菌在特定條件下的生存和生長是必不可少的，并且在發(fā)病機制中起著調節(jié)作用，該酶位于碳代謝與宿主氧化還原穩(wěn)態(tài)之間的交叉點[24].FBA失活可以抵抗體內氧化應激反應，這一特征促使研究者首先測試了編碼過氧化氫酶的獨特基因katG的表達，該過氧化氫酶將H2O2分解成H2O和O2.研究表明，H2O2在感染katG突變體細菌的巨噬細胞溶質中積累，并通過Ca2+觸發(fā)炎癥反應[25-26].在培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)細菌，qRT-PCR分析顯示弗朗西塞拉菌FBA失活引起其katG基因轉錄增加12倍.當FBA突變體細菌感染巨噬細胞時，其調控katG表達比野生型菌調控katG表達上調了7倍，表明FBA與katG之間是“負反饋調節(jié)”關系.FBA介導的katG轉錄表達在宿主細胞溶質中進行，成為調節(jié)受感染細胞的氧化還原狀態(tài)的手段，可調控促炎癥細胞因子IL-6產生.當宿主體內炎癥反應發(fā)生時，細菌將調節(jié)自身FBA的轉錄，用來維持細胞體內穩(wěn)定狀態(tài)，使細菌在宿主體內能更好的生存.在釀酒酵母中，Ⅱ類FBA除了在糖酵解中的功能之外，還與RNA聚合酶Ⅲ發(fā)生物理相互作用，并在控制其轉錄中起作用.在生物體內RNA聚合酶Ⅲ主要負責tRNA，5S RNA及其他小RNA的轉錄，Cies＇la等[27]通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)酵母中FBA與RNA聚合酶Ⅲ復合物發(fā)生相互作用，且失活的FBA過量產生仍能抑制酵母細胞的表型，表明FBA在RNA聚合酶Ⅲ轉錄中的作用與其催化活性無關.FBA通過促進RNA聚合酶Ⅲ與染色質的結合來加強RNA聚合酶Ⅲ的轉錄.因此，除在糖酵解中的功能外，F(xiàn)BA在RNA聚合酶Ⅲ的轉錄調控中也起到一定的作用.

2.5 參與對非生物脅迫反應

研究發(fā)現(xiàn)，番茄(Solanumlycopersicum)幼苗中FBA的表達及酶活性在遭受低溫脅迫時發(fā)生顯著變化[28].構建番茄FBA基因家族成員FBA7的RNAi表達載體，對低溫脅迫的番茄幼苗進行轉化，結果顯示，F(xiàn)BA7表達量減少，且FBA及卡爾文循環(huán)中其他主要酶的活性降低.與野生型相比，干擾FBA7引起植物凈光合速率、RuBP、可溶性糖含量、種子大小等指標下降，且在低溫、低光照強度條件下，表現(xiàn)出發(fā)芽率降低，超氧陰離子和過氧化氫水平升高.結果表明，番茄FBA7在調節(jié)番茄幼苗生長和耐低溫中具有重要作用.馬齒莧(Sesuviumportulacastrum)中FBA(SpFBA)cDNA全長1 452 bp，開放閱讀框為1 071 bp.半定量PCR分析表明，SpFBA在根中表達比在葉和莖中高，且在非生物，如海水、氯化鈉、脫落酸和聚乙二醇等刺激下，2～12 h內根中表達量顯著升高.這些結果表明，SpFBA在應對鹽脅迫和相關非生物脅迫下，在提高馬齒莧的生存能力方面起著重要作用[29].

3 FBA的應用

3.1 作為抗真菌的藥物靶點

Ⅱ類FBA(FBA-Ⅱ)存在于真菌、細菌和寄生蟲中，但在高等植物和哺乳動物中不存在，此特征使其成為開發(fā)新型抗真菌藥物的選擇性靶標.FBA在白色念珠菌(Candidaalbicans)中是一種相對豐富和穩(wěn)定的蛋白，在系統(tǒng)性念珠菌病小鼠中，消耗FBA可減弱白色念珠菌的毒力，說明FBA可用作抗真菌的藥物靶點[30].研究者通過虛擬篩選、結合-構像評價策略和酶活性測定等方法，合理設計了幾種具有較強抗真菌作用的新型白色念珠菌FBA-Ⅱ抑制劑(Ca-FBA-Ⅱ).研究發(fā)現(xiàn)，在Ca-FBA-Ⅱ的存在下，白色念珠菌的活性降低，且殺菌活性源于對真菌體內FBA-Ⅱ的抑制[31-33].因此，F(xiàn)BA可作為抗真菌感染的藥物靶點.

3.2 作為抗病原體候選疫苗

3.2.1 作為抗細菌的候選疫苗

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)是在嬰兒、老年人和免疫功能低下人群中發(fā)現(xiàn)的主要病原體.用肺炎鏈球菌重組FBA和佐劑共同免疫小鼠，會引發(fā)針對肺炎鏈球菌致命攻擊的保護性免疫反應.與單獨給小鼠注射佐劑相比，rFBA與佐劑共同作用會引起小鼠體內CD4+T細胞數(shù)量的顯著增加，同時小鼠體內的Th1與Th2型細胞因子數(shù)量也呈現(xiàn)上升趨勢，實驗數(shù)據顯示rFBA成為一種理想的抗肺炎鏈球菌候選疫苗[34].美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida,Phdp)是引起魚類“巴斯德氏菌病”的病原菌，被認為是全球海洋魚類養(yǎng)殖中最危險的細菌病原體之一.為防止其爆發(fā)傳播，Pham等[35]研究了FBA基因對發(fā)光桿菌癥的免疫保護作用.將Phdp菌的FBA重組蛋白免疫亞洲海鱸(Latescalcarifer)，結果顯示特異性抗體水平和溶菌酶活性增加.再用Phdp菌株侵染海鱸，結果顯示免疫FBA組魚在感染后3 d獲得高存活率(70.21 %)，且脾臟中細菌濃度顯著低于對照組.表明重組FBA蛋白成功誘導魚類防御，抑制Phdp菌入侵和繁殖.因此，F(xiàn)BA是防治魚類發(fā)光桿菌癥的良好候選疫苗.此外，通過免疫信息學預測綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)FBA的T細胞、B細胞表位肽疫苗，研究結果為后期抗菌疫苗開發(fā)提供依據[36].

3.2.2 作為抗支原體的候選疫苗

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是一種介于細菌與病毒之間的呼吸道病原體，該病原體使全球養(yǎng)豬業(yè)遭受巨大經濟損失.經SOE-PCR技術成功克隆Mhp的FBA基因，通過大腸桿菌BL21表達，親和層析法純化重組蛋白rFBA.流式細胞術結果顯示，F(xiàn)BA位于Mhp菌株表面，表明rFBA促進Mhp與豬氣管上皮細胞的粘附.用rFBA蛋白免疫兔子，獲得rFBA多克隆抗體，并分別用rFBA抗體、免疫前血清孵育Mhp，之后添加到含有豬氣管上皮細胞的細胞板中.實時定量PCR數(shù)據統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，rFBA抗體可抑制Mhp對氣管上皮細胞的粘附，使效率降低76 %[37].因此，F(xiàn)BA成為開發(fā)抗豬肺炎支原體及其類似病原體疫苗的潛在靶點.

3.2.3 作為抗寄生蟲的候選疫苗

研究者們在大腸桿菌中克隆并鑒定了旋毛蟲(Trichinellaspiralis)FBA基因，并對重組Ts-FBA(rTs-FBA)在旋毛蟲發(fā)育階段的表達規(guī)律及其對小鼠感染旋毛蟲的免疫保護作用進行了研究[38].結果表明，Ts-FBA基因在旋毛蟲不同發(fā)育階段均有表達，在旋毛蟲肌肉幼蟲的排泄-分泌產物中也有表達.用rTs-FBA對小鼠進行免疫，在每次免疫前和最后一次免疫7 d后收集小鼠血清樣品，并進行免疫熒光檢測，表明Ts-FBA主要定位于寄生線蟲的表面和胚胎.用rTs-FBA免疫的小鼠可產生以Th2為主的Th1/Th2混合體液免疫，且其IgG，IgE水平顯著升高.此外，用旋毛蟲侵染免疫后小鼠，結果顯示旋毛蟲成蟲量減少48.7 %，肌肉幼蟲量減少52.5 %，提示Ts-FBA是一種預防和控制旋毛蟲感染的有效疫苗靶點.Mccarthy等[39]通過PCR克隆得到盤尾絲蟲(Onchocercavolvulus)果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(Ov-FBA)全長序列，插入質粒pRSET中，構建重組質粒pOvFBA，并轉入大腸桿菌進行表達，且在盤尾絲蟲病動物模型中測試其保護效果.結果顯示，在接種疫苗的動物模型中幼蟲存活率降低50 %，表明Ov-FBA可作為誘導盤尾絲蟲病保護性免疫靶點的潛力.Marques等[40]在篩選曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)成蟲cDNA表達文庫時，發(fā)現(xiàn)并鑒定出FBA，將該基因克隆到pGEX-4T-3載體中，并在大腸桿菌中表達為融合蛋白(GST/P44)，接種重組P44的小鼠能夠產生高水平的IgG或IgG1，此外，用該抗原免疫小鼠可顯著保護57 %的小鼠免受曼氏血吸蟲感染，并減少肝肉芽腫的形成.因此，在寄生蟲免疫過程中FBA發(fā)揮了重要作用.

4 其他研究

FBA已被用作生物催化劑，用于合成一些藥物化合物.微生物金屬依賴型Ⅱ類FBA比哺乳動物體內的Ⅰ類FBA具有更高的穩(wěn)定性，是一種較好的工業(yè)催化劑[41].從超嗜熱菌(Aquifexaeolicus)中純化的FBA具有獨特的Ⅱ類醛縮酶特性，在100 ℃下表現(xiàn)出極強的熱穩(wěn)定性.基于以上特征，超嗜熱菌中的FBA可作為一種工業(yè)應用的高溫嗜熱酶[42].

5 總結與展望

FBA普遍存在于動物、植物和微生物中，是糖酵解途徑中的關鍵限速酶，是調節(jié)生物體內代謝作用不可或缺的.FBA除參與糖酵解外，在植物體內也是卡爾文循環(huán)中的主要酶之一，可對各種非生物脅迫發(fā)生響應，提高植物的生存能力.目前越來越多的研究關注細菌、真菌等生物的FBA作用，為深入揭示FBA功能奠定基礎.此外，F(xiàn)BA在抗真菌、細菌、寄生蟲方面的應用也越來越廣泛.通過分子生物學、免疫學、生物信息學等實驗方法，使得FBA成為開發(fā)抗細菌、真菌和寄生蟲疫苗的有效突破點[43-45].因此，探索FBA基因在病原體感染中的作用機制，對于高效疫苗的開發(fā)具有重要意義.