張 洋，譚韻湘，高譽(yù)珊，楊曉坤，栗晨璐，薛衛(wèi)國

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種原因不明并且起病隱匿的漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以記憶力和認(rèn)知能力障礙為主要臨床表現(xiàn)。細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid，Aβ)沉積所形成的老年斑(Senile plaques，SP)以及細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)是其兩大主要的病理特征。Aβ級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為Aβ處于AD發(fā)病的核心位置，Aβ產(chǎn)生或者清除失衡會(huì)造成大量Aβ堆積，產(chǎn)生神經(jīng)毒性、誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)以及導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡等一系列的AD病理特征[1-2]。神經(jīng)元內(nèi)Aβ一直是AD發(fā)病機(jī)制及治療的熱點(diǎn)，目前認(rèn)為神經(jīng)元內(nèi)Aβ可能是造成突觸功能及認(rèn)知功能損害的主要原因[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)內(nèi)體-自噬溶酶體途徑同時(shí)是重要的Aβ產(chǎn)生及清除途徑。細(xì)胞內(nèi)Aβ被自噬囊泡包裹形成自噬小體，由線粒體提供能量，動(dòng)力蛋白(Dynein)將其逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體,然后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，在溶酶體各種蛋白水解酶的作用下降解。Nixon等[5]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良性突起及神經(jīng)元內(nèi)存在大量自噬體和自噬溶酶體，說明AD患者自噬功能障礙，Aβ逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和降解受阻，同時(shí)自噬體、自噬溶酶體的大量存在導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Aβ大量產(chǎn)生及細(xì)胞外分泌。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺干預(yù)可以降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ水平[6-9]，改善小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，其機(jī)制可能是通過自噬溶酶體途徑[10-13]。但是針刺降低小鼠海馬Aβ水平相關(guān)機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)選取AD病理初期的6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型，針刺“百會(huì)”“涌泉”二穴，觀察研究逆向轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力蛋白Dynein和自噬溶酶體的降解相關(guān)蛋白組織蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)變化水平以及電針對(duì)其表達(dá)水平的影響，旨在闡明針刺是否通過調(diào)節(jié)機(jī)體的自噬水平而改善AD患者的學(xué)習(xí)和記憶能力，以期為臨床電針治療AD患者提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡健康SPF級(jí)雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠20只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008]；同月齡雄性健康野生型C57BL/6小鼠10只，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010]。小鼠均飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，采用自然節(jié)律光照，自由進(jìn)食、飲水，溫度(23±1)℃，濕度40%～70%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)基因小鼠滿6月齡時(shí)稱重排序，體質(zhì)量約為(28.10±1.58)g，利用隨機(jī)數(shù)法將轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組(M)和電針組(E)，10 只/組，野生C57BL/6小鼠10只為空白對(duì)照組(C)，體質(zhì)量約為(29.05±2.27)g。

1.2 干預(yù)方法

1.2.1 電針組 將小鼠用自制鼠袋俯臥位固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上，“百會(huì)”“涌泉”二穴參照第9版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及比較解剖學(xué)取穴定位。75%酒精常規(guī)消毒后，針刺深度為2～3 mm，“百會(huì)”穴行手針平刺留針，雙“涌泉”穴直刺后接入韓式電針儀，采用疏密波，頻率1/50 Hz，強(qiáng)度1 mA，以小鼠保持安靜不掙扎嘶叫為度。留針15 min/次，隔日1次。共治療6周。

1.2.2 模型組、空白對(duì)照組 以相同方法固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上，15 min/次，隔日1次，共束縛6周。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1 試劑 兔源Dynein抗體(美國，Abcam，ab171964);兔源Cathepsin D抗體(美國，Abcam，ab75852);Aβ(4G8)(美國，Biolegend，800701);鼠源GAPDH(proteintech，60004-1)；鼠源辣根過氧化物標(biāo)記生物素(北京中杉金橋，ZB-2305);羊源辣根過氧化物標(biāo)記生物素(proteintech，SA00001-2);山羊抗小鼠熒光二抗(美國，Abcam，ab150115);山羊抗兔熒光二抗(美國，Abcam，ab150077)；BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊有限公司)。

1.3.2 儀器 一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)藥公司，0.25 mm×13 mm);LH202H型韓氏電針儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);冰凍切片機(jī)(德國，Leica);酶標(biāo)儀(美國，Bio-Rad);電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國，Bio-Rad);曝光機(jī)(美國，Bio-Rad)。

1.4 觀察指標(biāo)及取材、檢測(cè)方法

1.4.1 Morris水迷宮檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 各組小鼠干預(yù)6周后進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)。Morris水迷宮為一圓形水池，池壁內(nèi)有不同幾何圖形，分為4個(gè)不同象限，平臺(tái)置于第3象限中央，水溫在22 ℃左右，接入圖像采集系統(tǒng)記錄小鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間和游泳路徑。實(shí)驗(yàn)前1 d小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。

1.4.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 注水高于平臺(tái)1 cm，并倒入奶粉隱藏平臺(tái)，于1、2、4象限水池中點(diǎn)隨機(jī)面壁放入小鼠，若小鼠在60 s內(nèi)找到并爬上平臺(tái)，記錄其實(shí)際時(shí)間并在平臺(tái)上停留15 s；若小鼠60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)上，并停留15 s，記錄小鼠找到平臺(tái)時(shí)間為60 s。每天訓(xùn)練3次，每次間隔20 min，連續(xù)訓(xùn)練4 d,記錄逃避潛伏期及游泳軌跡。

1.4.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第5天，撤掉平臺(tái)，第1象限中點(diǎn)面壁放入小鼠，記錄60 s內(nèi)小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)以及在第3象限游泳路程。

1.4.2 取材方法 小鼠滿8月齡時(shí)取材，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉。兩只小鼠用2%多聚甲醛+2.5%戊二醛心臟灌注后斷頭取腦，并置于2%多聚甲醛+2.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定48 h，用于透射電鏡觀察。3只小鼠用4%多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛4 ℃固定72 h，梯度蔗糖脫水，OCT包埋，冠狀位冰凍切片，厚度為10 μm，-20 ℃冰箱保存，用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)。剩余5只小鼠斷頭取腦后，于冰上剝離小鼠海馬組織并迅速置于凍存管中，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測(cè)。

1.4.3 透射電鏡觀察海馬中自噬體、自噬溶酶體情況 取海馬CA1區(qū)大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，梯度丙酮脫水，純樹脂包埋，切片，2%醋酸雙氧鈾染色，2%檸檬酸鉛染色5～6 min，蒸餾水洗凈；H-7560型透射電鏡觀察自噬體及自噬溶酶體情況并拍照。

1.4.4 海馬Aβ及CTSD免疫熒光雙標(biāo) 取出冰凍切片，室溫復(fù)溫30 min;PBS沖洗;枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)15 min;PBS沖洗;山羊血清室溫封閉10 min;甩掉山羊血清封閉液，加入一抗(CTSD和4G8抗體等體積混勻)，4 ℃孵育過夜；次日，PBS沖洗；加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h；PBS沖洗；DAPI封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.4.5 Western blot檢測(cè)小鼠海馬CTSD與Dynein蛋白的相對(duì)表達(dá)量 稱取小鼠海馬組織，加入RIPA 裂解液和PMSF(RIPA：PMSF=100∶1)，于冰上用超聲儀充分研磨，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，提取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣Buffer,95 ℃加熱5 min，每孔上樣量為2.5 μL，SDS-PAGE分離電泳完成后，轉(zhuǎn)膜至0.45 μM PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST清洗，裁膜，加入一抗(CTSD，1∶10 000；DIC,1∶2 000；GAPDH，1∶50 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗，加入二抗(山羊抗兔HRP-IgG，1∶5 000；山羊抗鼠HRP-IgG，1∶50 000)，室溫下置于搖床孵育1 h，TBST清洗后滴加ECL發(fā)光液顯色，曝光，顯影。用Image J軟件分析各個(gè)條帶的灰度值，以GAPDH的灰度值為基準(zhǔn)線計(jì)算出各目標(biāo)條帶的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力代表性路線軌跡圖如圖1所示。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠平均逃避潛伏期增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組小鼠比較，電針組小鼠平均逃避潛伏期減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖2、表1所示。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠平均穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限游泳路程減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組小鼠比較，電針組小鼠平均穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限游泳路程增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如表2所示。

表1 各組小鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期時(shí)間比較

表2 各組小鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限游泳路程比較

2.2 各組小鼠海馬自噬體、自噬溶酶體比較

采用透射電鏡觀察各組小鼠海馬自噬體、自噬溶酶體情況，如圖3所示：空白對(duì)照組小鼠海馬中可觀察到少量的自噬溶酶體，未觀察到明顯營(yíng)養(yǎng)不良性突起(圖A、B)；模型組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中有大量的自噬體堆積，主要是在神經(jīng)元軸突末端(營(yíng)養(yǎng)不良性突起)(圖D)，胞漿內(nèi)可見許多自噬溶酶體(圖C)；電針組小鼠海馬神經(jīng)元軸突中也可以觀察到部分自噬體堆積，但明顯少于模型組(圖F)，胞體核周可見部分自噬溶酶體(圖E)。

2.3 CTSD和Aβ在小鼠海馬的免疫熒光共表達(dá)比較

自噬作為Aβ的一種重要降解方式，自噬泡包裹Aβ形成的自噬體，只有與溶酶體結(jié)合之后形成自噬溶酶體，在溶酶體中各種蛋白酶的作用下，才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。CTSD作為溶酶體中一種重要的蛋白水解酶，在Aβ的降解中發(fā)揮著重要的作用。為了進(jìn)一步說明CTSD和Aβ的相關(guān)情況，筆者標(biāo)記了二者在海馬中共表達(dá)情況，如圖4所示。CTSD為綠色熒光標(biāo)記，主要在核周(胞質(zhì))中表達(dá)；Aβ為紅色熒光標(biāo)記，表達(dá)位置并不局限于核周(胞質(zhì))，并且二者存在共表達(dá)關(guān)系，說明被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的Aβ，可能是通過CTSD進(jìn)行降解。

2.4 各組小鼠海馬逆行軸突轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力蛋白中間鏈(DIC)及CTSD表達(dá)量比較

在神經(jīng)元自噬過程中，軸突末端形成的自噬體在動(dòng)力蛋白的協(xié)助下沿微管逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，然后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，在溶酶體中各種水解酶的作用下發(fā)生降解?？梢妱?dòng)力蛋白和組織蛋白酶(組織蛋白酶D)在神經(jīng)元自噬過程中發(fā)揮著重要的作用。所以檢測(cè)了動(dòng)力蛋白中間鏈(DIC)和CTSD(組織蛋白酶D)的表達(dá)水平，以反映自噬流的運(yùn)輸及降解狀態(tài),見圖5。Western Blot檢測(cè)顯示：與空白對(duì)照組比較，模型組DIC表達(dá)量降低，CTSD表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組DIC表達(dá)量增加，CTSD表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠海馬DIC和CTSD相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

作為AD的典型病理特征之一，老年斑由腦神經(jīng)細(xì)胞外的β淀粉樣蛋白沉積所形成。Aβ級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為Aβ在AD的致病級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心位置,機(jī)體生成的Aβ如果不能及時(shí)有效地清除，具有神經(jīng)毒性作用的Aβ就可能造成神經(jīng)元及突觸損傷，從而造成AD患者認(rèn)知功能障礙。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ生成、聚集以及認(rèn)知功能障礙，能在一定程度上模擬AD患者的病理發(fā)展過程，是目前國際上較為公認(rèn)的研究Aβ水平變化及機(jī)制的有效AD評(píng)價(jià)模型[14]。6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)已出現(xiàn)老年斑，并出現(xiàn)自噬溶酶體功能紊亂，所以本實(shí)驗(yàn)采用6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，從自噬溶酶體途徑角度探討電針降低AD患者腦內(nèi)Aβ水平的可能機(jī)制。

自噬通常被認(rèn)為是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，自噬可以清除機(jī)體錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)，維持神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[15]。在AD患者腦中，自噬可以清除機(jī)體產(chǎn)生過多的Aβ，但同時(shí)自噬可能是一把雙刃劍[16]。在AD早期，自噬功能的增強(qiáng)會(huì)加快Aβ的清除，防止其毒性作用，保護(hù)神經(jīng)元，但隨著毒性蛋白的不斷增加，機(jī)體自噬溶酶體系統(tǒng)被破壞，增強(qiáng)機(jī)體自噬功能不但不能加快Aβ清除，反而可能會(huì)產(chǎn)生更多的Aβ，促使神經(jīng)元變性。自噬溶酶體途徑又稱為自噬流，包括自噬啟動(dòng)、自噬形成、自噬體溶酶體融合以及蛋白質(zhì)降解4個(gè)階段，其中任何一個(gè)階段出現(xiàn)問題都會(huì)使Aβ不能被有效地清除，造成Aβ的堆積。神經(jīng)元突起中存在驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)介導(dǎo)的順向運(yùn)輸以及動(dòng)力蛋白(Dynein)介導(dǎo)的逆向運(yùn)輸，并且動(dòng)力蛋白作為自噬體沿微管系統(tǒng)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體的唯一蛋白，動(dòng)力蛋白中間鏈(Dynein intermediate chain, DIC)作為動(dòng)力蛋白的重要組成部分，參與自噬底物的結(jié)合，并且對(duì)于自噬體與溶酶體的結(jié)合也有著非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，Aβ參與Dynein競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而減少Dynein與自噬體結(jié)合，導(dǎo)致自噬體不能被及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體完成降解。與正常人比較，AD患者腦內(nèi)DIC表達(dá)量同樣下降[18]。對(duì)于AD患者而言，本就不足的Dynein，還有部分自噬體不能與其有效結(jié)合，造成神經(jīng)元突起中大量自噬體堆積。而作為溶酶體中重要水解酶的CTSD，參與機(jī)體錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的降解，有研究發(fā)現(xiàn)，CTSD參與神經(jīng)元中許多蛋白質(zhì)(包括APP)降解[19-20]，所以對(duì)于自噬-溶酶體系統(tǒng)，CTSD同樣非常重要。

本實(shí)驗(yàn)選取6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠電針干預(yù)6周，8月齡時(shí)取材。此時(shí)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)已經(jīng)有大量老年斑，小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降，機(jī)體的自噬功能處于紊亂狀態(tài)，造成部分Aβ堆積形成老年斑。Morris水迷宮結(jié)果顯示模型組小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降。本研究關(guān)注的是細(xì)胞內(nèi)Aβ及自噬轉(zhuǎn)運(yùn)、降解狀態(tài)。透射電鏡觀察到其海馬中有大量的自噬體堆積，主要是在神經(jīng)元軸突末端，以及胞體許多自噬溶酶體堆積，說明雙轉(zhuǎn)基因小鼠自噬體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、自噬體溶酶體融合以及蛋白質(zhì)降解發(fā)生障礙。免疫熒光結(jié)果顯示CTSD和Aβ在小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體存在共表達(dá)，說明CTSD作為溶酶體中一種重要的水解酶可能參與細(xì)胞內(nèi)Aβ降解；由于自噬是Aβ一種重要的降解途徑，被自噬泡包裹的Aβ(突起上)經(jīng)動(dòng)力蛋白逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到胞體完成降解。Western Blot結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組動(dòng)力蛋白中間鏈(DIC)表達(dá)量降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了雙轉(zhuǎn)基因小鼠自噬體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的觀點(diǎn)；由于過多的自噬體在神經(jīng)元軸突末端堆積，機(jī)體為了加快自噬體的降解而產(chǎn)生更多的組織蛋白酶助其降解，故較空白對(duì)照組，模型組CTSD表達(dá)量反而增加，形成胞體的許多自噬溶酶體堆積。所以，在AD病理中期，可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體紊亂的自噬狀態(tài)，以達(dá)到保護(hù)機(jī)體治療AD患者的目的。

針對(duì)AD患者“腎氣虧虛，痰濁蒙竅”的病機(jī)特點(diǎn)，筆者選用“百會(huì)”“涌泉”二穴“益腎祛濁，開竅醒神”。Morris水迷宮結(jié)果顯示，電針組逃避潛伏期和目標(biāo)象限游泳路程優(yōu)于模型組，說明電針可有效改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。電針作為非藥物療法，可能通過調(diào)節(jié)自噬，降解細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，防治有害蛋白的體內(nèi)堆積，保持神經(jīng)系統(tǒng)的功能。自噬體的運(yùn)輸以及自噬溶酶體的降解作為自噬的重要組成部分，同樣也應(yīng)該受到電針的影響。本實(shí)驗(yàn)Western Blot結(jié)果表明：雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)中Dynein表達(dá)量降低，CTSD表達(dá)量升高；而電針能升高Dynein水平，降低CTSD表達(dá)量，表明針刺“百會(huì)”“涌泉”二穴治療AD的生物學(xué)機(jī)制可能是提高海馬神經(jīng)元逆向轉(zhuǎn)運(yùn)能力，平衡溶酶體中CTSD的水平，從而達(dá)到調(diào)整機(jī)體紊亂的自噬狀態(tài)，降低AD患者腦內(nèi)Aβ等有害蛋白的堆積，改善其學(xué)習(xí)和記憶能力，達(dá)到預(yù)防和治療AD的目的。但電針調(diào)節(jié)機(jī)體自噬的確切機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究，以明確其確切的途徑及作用靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究證據(jù)。