陸家琪，李曉林

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海 200233)

近年來骨科技術(shù)飛速發(fā)展，但大面積骨缺損仍是骨科手術(shù)亟待解決的一大難題[1]。目前，治療的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是自體骨移植[2]。然而，自體骨在大的骨缺損應(yīng)用中受到許多限制，如繼發(fā)性創(chuàng)傷、疼痛、移植來源受限等[2]。同種異體骨和異種骨移植雖然克服了自體骨移植的缺點，但因排斥反應(yīng)的可能性大、疾病的潛在傳播，使其在臨床應(yīng)用上受到阻礙[2-3]。

近年來由于組織工程技術(shù)的發(fā)展，人工骨材料得到了廣泛的研究。三維多孔支架為種子細(xì)胞提供一個模板來刺激細(xì)胞增殖和分化，同時相互連接的孔結(jié)構(gòu)，允許營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入支架[1，4]。多孔絲素蛋白(silk fibroin，SF)由于具有良好的生物相容性和可降解性，在骨組織工程領(lǐng)域引起了越來越多的關(guān)注[5]。然而，較弱的成骨誘導(dǎo)活性阻礙了絲素蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用[6-7]。丹酚酸B(salvianolic acid B，SB)是丹參提取物中的主要生物活性成分，顯示多種生物學(xué)效應(yīng)，目前臨床已將其用于治療缺血再灌注損傷、腎損傷、肝損傷和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[8-10]。最近的研究表明，SB能夠通過促進(jìn)成骨和成血管作用減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松，并通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)信號途徑提供成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性[11]。然而，關(guān)于SF裝載SB對骨缺損的修復(fù)尚缺乏詳盡的研究。

本研究通過不同劑量的SB被均勻地滴加到絲素蛋白溶液中并通過冷凍凍干方法形成多孔支架；通過研究SB的成骨分化以及在骨缺損修復(fù)中的作用，為加載SB的SF組織工程支架修復(fù)骨缺損提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 主要試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimum essential medium α，MEM-α)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本Dojindo公司；堿性磷酸酶活性試劑盒購自南京建成生物公司；Triton X-100購自北京索萊寶公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒均購自日本Takara公司。

主要設(shè)備：掃描電鏡(日本日立公司)、多功能酶標(biāo)儀(美國美谷分子儀器公司)、倒置顯微鏡(德國萊卡公司)、Micro-CT(Skyscan 1176，美國Bruker公司)、硬組織切片機(jī)(SP1600，德國徠卡公司)。

1.2 含有不同劑量SB的多孔SF支架的制備 首先，根據(jù)文獻(xiàn)報道合成SF[12]。然后將0.2 mg、1 mg和5 mg的SB分別加入5 mL的二次蒸餾水(dd H2O)中，待充分溶解后將0.5 g的SF分別加入不同質(zhì)量濃度的SB溶液中，4℃條件下磁力攪拌1 h，單純的SF當(dāng)作對照組。然后，分別將40 μL 和200 μL混合溶液分別加入直徑為5 mm和10 mm的圓柱形模具中，-20℃過夜后在-60℃下凍干獲得含有不同質(zhì)量濃度SB的SF多孔支架，即低濃度支架(SF/LSB)、中濃度支架(SF/MSB)和高濃度支架(SF/HSB)。支架在進(jìn)行體外及體內(nèi)實驗前通過γ-射線輻照滅菌。

1.3 SB在SF多孔支架中的釋放 為了多孔SF支架中SB的釋放，將一個直徑為10 mm的樣品浸入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，并在37℃條件下以100 rpm的轉(zhuǎn)速在搖床上搖動。在指定的時間點(1 d、3 d、7 d、10 d、14 d、20 d、30 d)，從離心管中獲得1 mL PBS，并添加1 mL新鮮的PBS[13]。在酶標(biāo)儀286 nm的波長下評估SB的釋放。根據(jù)SB的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，計算SB釋放百分比。每組實驗重復(fù)3次。

1.4 條件培養(yǎng)基對rBMSCs細(xì)胞增殖的影響 據(jù)文獻(xiàn)報道提取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)，P3～4代用于細(xì)胞實驗[13]。

將一個直徑為10 mm的支架放入37℃條件下的標(biāo)準(zhǔn)MEM-α培養(yǎng)基中浸泡10 d，10 d后收集四組不同質(zhì)量濃度支架組的條件培養(yǎng)基并用于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)，收集的條件培養(yǎng)基放置在4 ℃冰箱保存7 d。

將含有2×103細(xì)胞的細(xì)胞懸液(200 μL)添加到96孔板中，次日更換條件培養(yǎng)基在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d、3 d和7 d，每3天換液1次。采用CCK-8試劑來評估體外不同濃度SB的條件培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖的影響[14]。

1.5 rBMSCs細(xì)胞堿性磷酸酶活性 為了評估含有不同濃度SB的條件培養(yǎng)基對rBMSC早期成骨分化的影響，8×103細(xì)胞接種于24孔板上并分別培養(yǎng)7d和14d，每3天換液1次。在預(yù)定的時間，使用200 uL 0.2% Triton X-100裂解細(xì)胞并在4℃條件下14 000 rmp離心15 min，根據(jù)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性試劑盒操作指南將50 μL上清液加入150 μL的工作液中，用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度，測定ALP存在時對硝基苯磷酸鹽向?qū)ο趸椒拥霓D(zhuǎn)化[14]。每組實驗重復(fù)操作3次。

1.6 rBMSCs細(xì)胞的茜素紅染色 為了評估含有不同濃度SB的條件培養(yǎng)基對rBMSC晚期成骨分化的影響，8×103細(xì)胞接種于24孔板上并分別培養(yǎng)21 d，每3天換液1次。在預(yù)定的時間，使用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞并在說明書指導(dǎo)下，根據(jù)茜素紅S(alizarin red S，ARS)染色試劑盒操作指南將200 uL茜素紅染色液加入24孔板中，用光學(xué)顯微鏡拍照記錄，收集數(shù)據(jù)。每組實驗重復(fù)操作3次。

1.7 rBMSCs細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá) 將rBMSCs按5×104/孔接種在6孔板中，并在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。采用RT-PCR法檢測不同濃度SB對rBMSCs成骨基因表達(dá)的影響。以GAPDH mRNA作為對照組，獲得Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用交點法計算得到Ct值，即通過擴(kuò)增曲線與閾值線的交點來計算Ct值。相對定量的分析結(jié)果要通過△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量為2ΔCt=2Ctm-Ctn，各組樣本基因之間的表達(dá)量差異數(shù)據(jù)分析則通過2ΔΔCt=2ΔCt1-ΔCt2計算，繪制柱狀圖分析結(jié)果[13]。所有樣品一式三份進(jìn)行測試。

1.8 SD大鼠顱骨缺損模型 如文獻(xiàn)報道所述根據(jù)SD大鼠顱骨骨缺損的手術(shù)模型建立標(biāo)準(zhǔn)的臨界性骨缺損模型[13]。簡而言之，應(yīng)用0.5%的戊巴比妥鈉按9 mL/kg體重通過腹腔內(nèi)注射麻醉6只250～300 g的SD雄性大鼠，在頭皮正中進(jìn)行1.5 cm左右的矢狀切口，切開筋膜，用小的骨膜剝離子將顱骨表面骨膜剝向兩側(cè)暴露“人”字縫，接著在“人”字縫的近端用直徑5 mm的牙科環(huán)鉆在矢狀縫的兩側(cè)顱骨表面各鉆出直徑5 mm的全層顱骨缺損。隨后將兩組直徑5 mm厚度約2 mm經(jīng)過γ射線滅菌的多孔支架分別植入缺損區(qū)，一側(cè)植入SF/MSB支架，另一側(cè)植入SF支架作為對照，逐層縫合骨膜、皮下組織及皮膚。術(shù)后3 d肌肉注射青霉素鈉4萬單位預(yù)防感染。在大鼠顱骨缺損手術(shù)后的2周、4周和6周，分別通過腹腔內(nèi)注射鹽酸四環(huán)素(tetracycline，TE，25 mg/kg體重)，茜素紅(alizarin red，AL，30 mg/kg體重)和鈣黃綠素(calcein，CA，20 mg/kg體重)標(biāo)記新骨再生[1]。

1.9 Micro-CT分析缺損區(qū)新骨再生 使用Micro-CT掃描成像分析系統(tǒng)評價大鼠顱骨缺損區(qū)新骨再生。骨組織標(biāo)本掃描的層厚為18 μm，經(jīng)過Micro-CT掃描后直接獲得其斷層掃面的圖片，利用Micro-CT系統(tǒng)配套的軟件進(jìn)行相關(guān)三維圖像的重建和具體數(shù)據(jù)指標(biāo)的分析。利用CT-Vol軟件構(gòu)建其三維重建骨組織圖片；依次利用DataViewer軟件和CT-An軟件選定的層面范圍內(nèi)逐層手工選擇顱骨缺損內(nèi)感興趣區(qū)域，調(diào)整參數(shù)對植入支架范圍內(nèi)的骨生成情況進(jìn)行定量分析，自動計算確定骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density，BMD)，骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)[14]。

1.10 硬組織切片及染色分析骨再生 顱骨標(biāo)本在10%中性福爾馬林固定液中固定48 h后，酒精梯度脫水(70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%-Ⅰ及100%-Ⅱ)，連續(xù)兩次無水乙醇脫水后將標(biāo)本放入純的二甲苯中透明2 h，然后包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)中。包埋成功后，使用硬組織切片機(jī)將顱骨標(biāo)本縱向切片切成150～200 μm厚的切片，然后使用502膠粘到塑料載玻片上并用砂紙打薄、拋光至約50 μm厚度。使用共聚焦激光掃描顯微鏡(confocallaser scanning microscope，CLSM，Leica)檢測切片并進(jìn)行圖像采集和數(shù)據(jù)分析連續(xù)三色序列熒光標(biāo)記礦化的骨組織[14]。

將切片用van Gieson’s染色以評價顱骨缺損區(qū)新骨形成，紅色區(qū)域代表再生的新骨組織，黑色區(qū)域代表支架殘留。通過Image Pro 5.0系統(tǒng)(Media Cyber netics，Rockville，MD，USA)采集圖像，在4個隨機(jī)選擇的切片上定量評價新骨形成的面積[13]。

2 結(jié) 果

2.1 SF支架的結(jié)構(gòu)以及SB在SF多孔支架中的釋放 根據(jù)圖1可以看到SF支架呈多孔互連結(jié)構(gòu)。SpectraMax M2酶標(biāo)儀(OD 286 nm)用于測定溶液中SB的含量以及用于計算SB釋放百分比。釋放結(jié)果顯示，三組含有不同質(zhì)量濃度SB的SF支架顯示類似的釋放曲線。如圖2所示，第1天PBS中的SB從支架中的釋放百分比分別約為42.32%、40.40%和39.73%；在第10天SB的釋放達(dá)到頂峰，三組支架的釋放百分比分別約為79.63%、79.49%和80.14%。隨后，SB的釋放速率顯著減慢；第30天時，三組支架中SB的累積釋放百分比約為85%。這些結(jié)果表明，SB的釋放在前10天迅速，然后逐漸減慢。

圖1 掃描電鏡下的SF多孔結(jié)構(gòu) 圖2 SB在SF多孔支架中的緩釋結(jié)果

2.2 條件培養(yǎng)基促進(jìn)rBMSCs增殖 根據(jù)SB的釋放試驗顯示三組含有不同含量SB的SF支架條件培養(yǎng)基中SB的濃度分別約為0.89 μM、4.42 μM和22.30 μM。CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示SB以濃度依賴性的方式促進(jìn)rBMSCs的增殖，但是SF/MSB和SF/HSB組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)；另外，細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d時可觀察到SF/HSB組細(xì)胞增殖較SF/MSB組慢，這一現(xiàn)象可能與培養(yǎng)基中SB的濃度較高，有一定毒性有關(guān)。

表1 不同濃度SB條件培養(yǎng)基的rBMSCs細(xì)胞增殖實驗結(jié)果

2.3 SB條件培養(yǎng)基促進(jìn)rBMSCs早期成骨分化 隨著培養(yǎng)時間的延長，rBMSCs細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d時ALP的活性較培養(yǎng)7 d時明顯增高；但是ALP活性定量檢測顯示SF/MSB和SF/HSB兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。這一結(jié)果說明SB能夠明顯地促進(jìn)rBMSCs的早期成骨分化，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后rBMSCs細(xì)胞ALP活性表達(dá)

2.4 SB條件培養(yǎng)基促進(jìn)rBMSCs晚期成骨分化 rBMSCs細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d時ARS的活性檢測結(jié)果見圖3，在SF中加入不同濃度的SB可以促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)的形成，但是對于鈣結(jié)節(jié)陽性區(qū)域面積統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：SF/LSB和SF/MSB兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。這一結(jié)果說明SB能夠明顯地促進(jìn)rBMSCs的早期成骨分化，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖3 紅色塊狀結(jié)節(jié)為成骨分化晚期得到的鈣結(jié)節(jié)(茜素紅染色，×100)

表3 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后rBMSCs細(xì)胞ARS活性表達(dá)

2.5 SB條件培養(yǎng)基促進(jìn)rBMSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá) 為了進(jìn)一步證實SB對rBMSCs細(xì)胞成骨分化的影響。我們通過PCR檢測了成骨過程中幾個重要的標(biāo)記基因如ALP、I型膠原(collagen I，COL1)、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2，RUNX2)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)。表4顯示，與單純的SF組相比，含有SB組培養(yǎng)的rBMSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)均上調(diào)，并且SF/MSB和SF/HSB組較SF/LSB組成骨相關(guān)基因的表明均明顯增高(P<0.05)。但是，SF/MSB和SF/HSB組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步說明了SB能夠促進(jìn)rBMSCs的成骨分化。

表4 SB條件培養(yǎng)基對rBMSCs細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 Micro-CT分析SF/MSB促進(jìn)骨再生 體外結(jié)果顯示攜載SB的SF多孔支架能夠明顯地促進(jìn)rBMSCs的成骨分化，為了進(jìn)一步驗證SF/SB支架在體內(nèi)對骨再生的作用，我們將SF/MSB多孔支架植入大鼠體內(nèi)8周。8周后從Micro-CT三維重建影像正面、背面以及橫斷面可以明顯地觀察到攜載SB的SF支架能夠更好地促進(jìn)局部缺損區(qū)的新骨再生(見圖4a)；缺損區(qū)Micro-CT定量分析結(jié)果也顯示SF/MSB組BV/TV(36.91±4.35)%明顯高于SF組的BV/TV(5.44±1.33)%，P<0.05(見圖4b)；BMD在SF/MSB組(0.45±0.06)g/cm3顯著高于SF組(0.08±0.03)g/cm3，P<0.05(見圖4c)。Micro-CT結(jié)果進(jìn)一步證明了SB不僅可以在體外促進(jìn)rBMSCs的增殖和成骨分化，還可以在體內(nèi)促進(jìn)骨再生。

a 三維影像的正面、背面及橫斷面

b 缺損區(qū)新骨百分比 c 缺損區(qū)骨密度圖4 組間骨再生Micro-CT定量分析比較

2.7 序列熒光標(biāo)記新骨礦化 序列熒光標(biāo)記技術(shù)是一種標(biāo)記礦化組織和評價骨再生過程中新骨礦化的時間進(jìn)程的技術(shù)。在不同時間點注射不同的鈣結(jié)合染料觀察骨再生。雖然礦化骨組織百分比較低，但SF/MSB組在2周(TE黃，早期成骨)和4周(AL紅，新骨礦化最活躍階段)的熒光陽性面積明顯大于SF組(見圖5)。6周后(CA綠)，SF/MSB組較4周時礦化度未見顯著升高，提示骨改建階段，但SF/MSB組仍明顯高于SF組(見圖6)。

圖5 序列熒光標(biāo)記新骨再生 圖6 組間熒光面積定量分析比較

2.8 硬組織切片染色 為了進(jìn)一步證實SB在體內(nèi)對新骨再生的影響，我們采用van-Gieson骨膠原染色對缺損區(qū)新生骨形成進(jìn)行分析。在van Gieson染色切片中，我們發(fā)現(xiàn)SF/MSB組有更多的新骨形成(37.35±5.25)%(見圖7)。相比之下，SF組缺損區(qū)邊緣有少量的新生骨(8.24±1.71)%，定量分析顯示兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖8)。

圖7 紅色以及紅褐色區(qū)域為骨膠原陽性區(qū)域(VG染色，×50)

圖8 組間VG染色定量分析比較

3 討 論

這項研究驗證了具有生物活性功能的SB可以從多孔SF支架中緩慢釋放。體外細(xì)胞和體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明多孔SF支架中釋放的SB可以促進(jìn)rBMSCs的成骨分化和增強(qiáng)多孔SF支架修復(fù)顱骨缺損。我們的結(jié)果證明SB可能是一個潛在的生物活性藥物，促進(jìn)骨再生。

目前，多孔SF因其優(yōu)異的生物相容性、可降解性得到了越來越多的研究，特別是作為骨組織工程支架[5]。然而，由于缺乏生長因子等骨誘導(dǎo)因素，單純的SF支架在動物體內(nèi)植入后新骨形成受到限制[6-7]?？紤]到骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP2)等生長因子的副作用，越來越多的研究轉(zhuǎn)向于發(fā)展具有低生物毒性可替代的成骨誘導(dǎo)活性分子[15-16]。SB已被證明是一種具有生物活性的植物分子，具有骨誘導(dǎo)作用，具有血管生成作用和低細(xì)胞毒性[11]。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B在多孔SF支架中釋放穩(wěn)定，但10d后釋放動力學(xué)逐漸降低。根據(jù)SB的累積釋放曲線我們注意到，SB在低、中、高濃度下的釋放曲線非常相似，這表明了相似的釋放曲線和穩(wěn)定性。在本研究中約80%的SB在前10天內(nèi)從支架中釋放，比之前的研究結(jié)果略高[17]，這可能與不同成分的運(yùn)輸載體有關(guān)。先前的細(xì)胞研究報道顯示0.1～5 μM的SB能夠促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化[11]；本研究中，SF/LSB組、SF/MSB組和SF/HSB組在浸泡10 d后條件培養(yǎng)基中的SB最終濃度分別約為0.89、4.42和22.30 μM；成骨分化檢測結(jié)果顯示和之前的研究一致，并且我們發(fā)現(xiàn)SF/HSB組和SF/MSB組相比并沒有顯著促進(jìn)rBMSCs的成骨分化。在我們的實驗中顯示22.30 μM的SB相比4.42 μM的SB沒有進(jìn)一步促進(jìn)rBMSC細(xì)胞的成骨分化，可能與高濃度的SB對細(xì)胞分化產(chǎn)生一定的抑制作用相關(guān)，另外在細(xì)胞增殖實驗也觀察到類似的趨勢，結(jié)果說明高濃度的SB對細(xì)胞增殖可能會存在抑制作用進(jìn)而抑制成骨分化。此外需要指出的是，由于類似的PH值，SB釋放到條件培養(yǎng)基中的濃度是根據(jù)SB從SF支架釋放到PBS中推測出來的。但需要注意的是，由于培養(yǎng)基與PBS的化學(xué)成分不同，可能導(dǎo)致SB的有效濃度略有差異[17]。總之，本研究證實了從SF支架中緩釋出來的SB能夠顯著促進(jìn)rBMSCs的增殖和成骨分化。

盡管體外已經(jīng)證實SB能夠促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化，但體內(nèi)骨再生是評估生物材料是否可以植入體內(nèi)的重要標(biāo)準(zhǔn)[18]。雖然SB在臨床上已經(jīng)作為多種疾病的治療用藥[19]，并且一些動物實驗研究發(fā)現(xiàn)SB可以改善去勢后大鼠的骨質(zhì)疏松表型[20]。然而，目前將局部緩釋的SB用于松質(zhì)骨缺損有相關(guān)報道[17]，而用于皮質(zhì)骨缺損修復(fù)的相關(guān)研究還較少。在本研究中，體內(nèi)實驗沒有研究SB的局部釋放，但是從Micro-CT影像學(xué)檢查、序列熒光標(biāo)記和骨膠原染色都進(jìn)一步證實了載有SB的多孔SF支架可以明顯增強(qiáng)皮質(zhì)骨缺損的骨修復(fù)。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了SB不僅可以在體外促進(jìn)成骨分化，還可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，為攜載SB的SF骨組織工程支架修復(fù)骨缺損提供了有力證據(jù)。

然而，本研究也存在一些局限性。盡管丹酚酸B對骨形成有顯著影響，但本實驗并沒有設(shè)置與自體松質(zhì)骨修復(fù)骨缺損做對照。另一方面，研究更高濃度的SB摻入能否進(jìn)一步提高骨缺損修復(fù)效果具有重要的科學(xué)意義。