張欣宜,蔣 藝,劉洪玲,宋龍祥,王騰飛

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物基材料與綠色造紙國家重點(diǎn)實(shí)驗室,山東 濟(jì)南 250353

固定化系統(tǒng)可以將作用酶附著在不溶性基質(zhì)上,提高酶穩(wěn)定性同時又可以實(shí)現(xiàn)酶重復(fù)利用的作用[1]。將酶進(jìn)行固定化可以解決酶在應(yīng)用中遇到的一些固有缺點(diǎn),如成本高、穩(wěn)定性差、不易恢復(fù)等[2]。因此,一種實(shí)用、有效的固定化策略對酶的廣泛應(yīng)用具有重要意義。

隨著多酶復(fù)合物不斷研究,相互作用多肽對系統(tǒng)已逐漸引起了廣泛的關(guān)注,作為一種相對成熟的體系,可以實(shí)現(xiàn)多酶的自組裝作用。SpyTag/SpyCatcher作為一組典型的相互作用多肽對,來自于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes),存在于CnaB2結(jié)構(gòu)域中[3]。SpyTag/SpyCatcher間會自發(fā)地在賴氨酸和天冬氨酸側(cè)鏈間形成共價異肽鍵[4]。依靠穩(wěn)定的結(jié)合使其應(yīng)用于多酶組裝具有了廣闊前景。同時,發(fā)現(xiàn)SpyTag/SpyCatcher無論是與作用酶的C端還是N端亦或是在中間進(jìn)行融合,都不會影響SpyTag/SpyCatcher之間的特異性結(jié)合[5]。在不同的pH、溫度以及緩沖條件下簡單地混合,就可以獲得較高結(jié)合率[4]。說明SpyTag/SpyCatcher之間的相互作用很容易產(chǎn)生且不受外部因素影響。所以本實(shí)驗利用SpyTag/SpyCatcher為多酶的固定化開辟了新的可能性。

麥芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)作為一組生產(chǎn)海藻糖的成熟催化酶系統(tǒng)。MTSase作用于麥芽糊精的還原端,將還原端兩個葡萄糖分子之間的α-1,4-糖苷鍵異構(gòu)化為α-1,1-糖苷鍵,形成海藻糖基團(tuán),MTHase再特異性地切割海藻糖基團(tuán)附近的α-1,4-糖苷鍵,獲得海藻糖[6]?；谶@兩種作用酶的催化過程,將SpyTag/SpyCatcher與這組作用酶結(jié)合,組裝形成多酶復(fù)合物,實(shí)現(xiàn)比游離酶更高的海藻糖轉(zhuǎn)化效率[7-8]。有研究顯示SpyTag/SpyCatcher經(jīng)常用于蛋白質(zhì)的組裝和構(gòu)建新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),而不會對蛋白質(zhì)表達(dá)造成影響[9]。因此,利用成熟的MTSase和MTHase催化系統(tǒng),探索以SpyTag/SpyCatcher為媒介的多酶固定化體系具有理論與實(shí)踐的雙重支持。

纖維素是一種理想固定化載體的組成成分[10]。與二氧化硅納米顆粒等載體相比,它不僅便宜、穩(wěn)定、可生物降解,還能以不同形式來獲得[11]。目前,已經(jīng)關(guān)注到了纖維素結(jié)合模塊(CBM)與纖維素的相互作用,并將其應(yīng)用于酶的一步純化固定化中[12]。CBM是對纖維素具有高親和力的非催化結(jié)構(gòu)模塊,具有廉價、不易受外界環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)且化學(xué)和物理性能穩(wěn)定[13],能夠與生物催化劑或難降解的底物緊密且長期地結(jié)合,促進(jìn)底物的有效降解,提高催化效果[14]。CBM是一個獨(dú)立的折疊單元,在與蛋白質(zhì)進(jìn)行融合時不會影響與纖維素間的吸附作用[15]。但是,CBM蛋白通常比較大,當(dāng)與其他蛋白進(jìn)行融合時,它們之間連接肽越長,表達(dá)水平可能會受到影響,引起酶活性降低。而SpyTag/SpyCatcher都是較小的蛋白,所以在參與融合時不會對酶活性有影響。

實(shí)驗采用環(huán)保型纖維微球作為CBM可吸附的固定化載體。將融合SpyCatcher的CBM吸附在纖維微球上,經(jīng)戊二醛交聯(lián)得到穩(wěn)定的SC-CBM固定化載體。利用SpyTag/SpyCatcher的特異相互作用和CBM吸附固定化的結(jié)合,完成不同類型作用酶的一步純化和固定化。只需將作用酶與SpyTag融合,即可使SC-CBM固定化載體成為通用的載體形式?；赟pyTag/SpyCatcher的多酶固定化系統(tǒng)可應(yīng)用于不同領(lǐng)域,從而獲得更高的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR I:美國紐英倫生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和無縫克隆試劑:南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Ni-柱蛋白純化柱:七海生物技術(shù)公司(上海)；BCA蛋白濃度測定試劑盒:博斯特生物技術(shù)公司(武漢)；蛋白電泳套裝DYY-12:賽默飛世爾科技(中國)有限公司；掃描電子顯微鏡Regulus 8220:日立(日本)；高效液相色譜儀:安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 菌株與質(zhì)粒

MTSase和MTHase基因序列treY、treZ均來自嗜酸熱硫化葉菌ATCC 33909(Sulfolobusacidocaldarius)(GenBankAHC51689.1和AHC51691.1)；CBM基因序列來自熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)(GenBank MH049738.1)；生工生物技術(shù)公司(中國)合成treY、treZ以及SpyCatcher與CBM的基因序列,由質(zhì)粒pUC57保存。pET-28a(+)表達(dá)載體:本實(shí)驗室提供；大腸桿菌BL21(DE3):南京諾唯贊生物科技股份有限公司。實(shí)驗中的所有引物均由生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)

合成的pUC57- treY/pUC57- treZ為模板,利用表1中的引物spyTag-treY-F/spyTag-treY-R、spyTag-treZ-F/spyTag-treZ-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得ST-treY和ST-treZ基因片段。將基因片段經(jīng)無縫克隆連接到Xho I、EcoR I雙酶切的pET28a(+)載體上,如圖1所示,獲得pET-TY和pET-TZ表達(dá)載體。以合成的pUC57-SpyCatcher和pUC57-CBM為模板,以相同的方式無縫克隆得到pET-CLC表達(dá)載體。獲得的pET-TY、pET-TZ和pET-CLC表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中轉(zhuǎn)化,保存于甘油管中(甘油終濃度20%)。

表1 實(shí)驗涉及的引物

圖1 pET-TY、pET-TZ和pET-CLC表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

1.4 蛋白純化

在低溫、8 000 r/min下離心10 min獲得菌體,經(jīng)10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)重懸后于超聲波破碎儀20 min(工作程序:4 s破碎,6 s停歇)。破碎液離心取上清液過0.22～0.45 μm濾膜,去除不溶性蛋白得粗酶液。采用親和層析法純化重組蛋白ST-treY、ST-treZ和SC-CBM[16]。Bradford法測定蛋白含量(以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白)[17],SDS-PAGE鑒定。

1.5 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

ST-treY和ST-treZ酶活測定分別采用了DNS法[18]和高效液相測定法[19]。ST-treY的酶活單位定義為pH 6.0,60 ℃條件下,每分鐘消耗1 μmol麥芽六糖所需的酶量。ST-treZ的酶活單位定義為pH 6.0,60 ℃條件下,每分鐘生成1 μmol海藻糖所需的酶量。與游離酶相比,探討重組酶的最佳溫度和pH,以及在最佳溫度和pH條件下的穩(wěn)定性。

1.6 SpyTag/SpyCatcher相互作用研究

經(jīng)純化,SC-CBM與ST-treY/treZ分別以物質(zhì)的量比1∶1在體外混合,pH 6.0,25 ℃,孵育24 h。通過形成的多酶復(fù)合物來探索SpyTag/SpyCatcher的相互作用。SDS-PAGE檢測結(jié)合的形成,通過ImageJ軟件輸出的平均灰度與光密度(OD)轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)量化。

1.7 固定化載體制備

采用離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯化物(BmimCl)制備纖維微球[20]。將微晶纖維素95 ℃溶解在離子液體中,均速攪拌,以無水乙醇作為凝固浴,采用擠壓球法制備。通過1%戊二醛交聯(lián)1 h。將微球與純化的SC-CBM,25 ℃下輕搖4 h得到SC-CBM固定化載體。測定吸附在纖維微球的SC-CBM蛋白含量確定載體回收率?；厥章?(初始蛋白濃度-剩余蛋白濃度)/初始蛋白濃度×100%。

1.8 一步純化固定化的條件優(yōu)化

首先經(jīng)多次實(shí)驗確定最佳生長量、IPTG添加量、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間的發(fā)酵條件,達(dá)到最佳表達(dá)水平后,再利用SC-CBM固定化載體,探究溫度、時間、pH以及載體添加量對一步純化固定化的影響,優(yōu)化固定化應(yīng)用條件。固定化速率=(初始酶蛋白量-固定化后剩余的蛋白量)/總蛋白量×100%。而粗酶液中的固定化率定義為酶活的回收率,酶活的回收率=(初始酶活性-固定化后剩余酶活性)/總酶活性×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 pET-TY、pET-TZ和pET-CLC的成功表達(dá)

如圖2 a所示,利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)驗證了成功構(gòu)建的pET-TY、pET-TZ和pET-CLC。由于重組酶C端融合了His標(biāo)簽,因此使用Ni-柱進(jìn)行純化。采用SDS-PAGE法對ST-treY、ST-treZ和SC-CBM的純化條帶進(jìn)行了驗證。如圖2 b所示,反映了純化前后的ST-treY、ST-treZ和SC-CBM蛋白條帶,大小分別約為87、66和35 kDa,與理論值有2～5 kDa的偏差,可能由于融合后蛋白質(zhì)的修飾作用引起的。

注:a)瓊脂糖凝膠電泳驗證圖；b)純化前后的SDS-PAGE凝膠電泳圖。

2.2 酶活測定

為了研究SpyTag與MTSase或MTHase的融合是否會引起酶活性的改變,通過與游離酶進(jìn)行比較,繪制表2融合SpyTag對MTSase/MTHase酶活的對比,結(jié)果表明,以麥芽六糖為底物測定ST-treY的比酶活為(108.7±5.2) U/mg,以麥芽四糖海藻糖為底物測定ST-treZ的比酶活為(244.5±6.1) U/mg。相較于游離的MTSase或MTHase的比酶活(107.6±4.5)或(239.8±4.3) U/mg而言,兩者并沒有明顯的差異。這些結(jié)果與之前報道的結(jié)果保持一致[21],表明了SpyTag的融合對作用酶的活性不會產(chǎn)生顯著影響。

表2 融合SpyTag對MTSase/MTHase酶活的對比

注:MTSase (treY)和MTHase (treZ)代表游離酶；ST-treY和ST- treZ代表重組酶。

2.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

固定化技術(shù)可能會對酶的穩(wěn)定性、催化性能產(chǎn)生影響[22]。所以探討了固定化中融合SpyTag重組酶的酶學(xué)性質(zhì),比較了游離酶和重組酶的最佳溫度和pH,測定了在最佳條件下的穩(wěn)定性。

2.3.1 游離酶和重組酶的最佳溫度

比較游離酶與重組酶ST-treY和ST-treZ在不同溫度下的相對酶活。定義最適溫度下的酶活為100%。如圖3a所示,ST-treY和游離酶的相對酶活都是在65 ℃時達(dá)到最佳,重組酶ST-treY的相對酶活性在45～60 ℃時比游離酶稍有升高。對于重組酶ST-treZ的最適溫度,如圖3b所示,在75 ℃下與游離酶酶活相似,ST-treZ的相對酶活在60～70 ℃時比游離酶略有提升。因此,融合SpyTag完成固定化的方法對作用酶的最佳溫度沒有顯著影響,且比游離酶在其他溫度環(huán)境下會表現(xiàn)出更好的酶活性。

注:a)游離酶與ST-treY最佳溫度對比圖；b)游離酶與ST-treZ最佳溫度對比圖。

2.3.2 溫度穩(wěn)定性

海藻糖的最佳轉(zhuǎn)化溫度為60 ℃,故將在該溫度下對重組酶與游離酶的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。定義0 h時的酶活為100%。如圖4 a所示,ST-treY的半衰期為11 d,比游離酶的半衰期增加1 d。如圖4 b所示,ST-treZ的半衰期為15 d,游離酶的半衰期則為14 d。在生產(chǎn)海藻糖時,重組酶與游離酶的半衰期僅有一天的差異,說明這種融合SpyTag的固定化方式對溫度的穩(wěn)定性沒有太大影響。

注:a)游離酶與ST-treY溫度穩(wěn)定性對比圖；b)游離酶與ST-treZ溫度穩(wěn)定性對比圖。

2.3.3 游離酶和重組酶的最佳pH

比較不同pH條件下的游離酶、ST-treY和ST-treZ的相對酶活性,定義最佳pH條件下的酶活為100%。如圖5 a所示,游離酶和ST-treY的最佳pH相同為pH 5.5,而在其他pH條件下,ST-treY的相對酶活也高于游離酶。ST-treZ的最佳pH,如圖5b所示,與游離酶最佳pH相似,為pH 6.0。因此,融合SpyTag并不影響作用酶的最佳pH。

注:a)游離酶與ST-treY最佳pH對比圖；b)游離酶與ST-treZ最佳pH對比圖。

2.3.4 pH穩(wěn)定性

比較游離酶和重組酶的pH穩(wěn)定性,定義在某pH條件下,0 h時的酶活為100%。如圖6中得出在pH≥5.0時,ST-treY和ST-treZ與游離酶的相對酶活無明顯差異。而在pH<5時,兩組重組酶的相對酶活都略高于游離酶。表明了融合SpyTag對作用酶的pH穩(wěn)定性影響不大。

注:a)游離酶與ST-treY pH穩(wěn)定性對比圖；b)游離酶與ST-treZ pH穩(wěn)定性對比圖。

2.4 SpyTag/SpyCatcher的相互作用

肽標(biāo)簽對于觀察和分離蛋白質(zhì)至關(guān)重要。與簡單的蛋白融合相比,SpyTag/SpyCatcher可以阻止重組酶在包涵體中的表達(dá),而且SpyTag/SpyCatcher的體外偶聯(lián)作用能快速形成不損傷蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)構(gòu)[23]。SpyTag基因融合的形式意味著重組酶和SpyCatcher之間通過自發(fā)的連接形成不可逆的共價鍵。在體外組裝成多酶復(fù)合物,探索SpyTag/SpyCatcher的相互作用效率。為了減少融合表達(dá)對SpyCatcher的影響,在 SpyCatcher和CBM之間引入了連接肽,以減少肽鍵形成的影響。通過SpyTag/SpyCatcher自發(fā)形成的不可逆肽鍵完成體外組裝。如圖7所示,SDS-PAGE驗證了ST-treY/treZ與SC-CBM相互作用的結(jié)果,1和2泳道觀察到不同于其他的新條帶,分別為126和106 kDa,證明ST-treY/treZ與SC-CBM的完成結(jié)合。利用梯度濃度SC-CBM純酶(圖7泳道)進(jìn)行SDS-PAGE,采用Image J軟件對灰度值進(jìn)行分析,得到OD值與蛋白質(zhì)含量之間的線性關(guān)系。按照1∶1進(jìn)行結(jié)合,通過未結(jié)合的SC-CBM和ST-treY/treZ蛋白含量,獲得SC-CBM與ST-treY/treZ結(jié)合率分別為60.3%和63%。

注:泳道1為SC-CBM與ST-treY結(jié)合；泳道2為SC-CBM與ST-treZ結(jié)合；泳道3～7為SC-CBM純酶濃度梯度

2.5 SC-CBM固定化載體

利用CBM吸附纖維素的功能,將SC-CBM吸附在纖維微球得到SC-CBM固定化載體。但CBM和纖維微球的結(jié)合是可逆的,當(dāng)CBM沿著底物向前移動時,在末端可能會發(fā)生脫落,所以需戊二醛進(jìn)行交聯(lián),獲得穩(wěn)定的SC-CBM固定化載體。纖維微球吸附前初濃度為414.64 μg/mL,通過測定微球吸附前后的蛋白質(zhì)濃度的變化,得到平均回收率約為79.8%。這與2019年Zhao等人的研究結(jié)果相符[15]。在此基礎(chǔ)上,CBM和纖維微球的吸附效果,為后續(xù)實(shí)驗創(chuàng)造了可能。

2.6 一步純化固定化條件優(yōu)化

通過SpyTag/SpyCatcher相互作用,同時完成酶的純化和固定化,減少了復(fù)雜的純化過程,并直接將作用酶與固定化載體結(jié)合。如圖8所示,掃描電子顯微鏡觀察纖維微球,表面粗糙、不均勻,帶有褶皺和微孔,可以增加酶的附著面積,從而促進(jìn)作用酶的固定化效果。將SC-CBM固定化載體加入到ST-treY和ST-treZ重組酶,SEM表明,與纖維微球的褶皺表面相比,固定化后,微球表面出現(xiàn)了大量的白色附著物,形成鮮明對比。這也進(jìn)一步說明了SpyTag/SpyCatcher作用與固定化系統(tǒng)的可行性。隨著SC-CBM和ST-treY/ST-treZ的體外相互作用,發(fā)現(xiàn)ST-treY和ST-treZ在相似的固定化條件下,固定化速率是相同的。因此,以ST-treY為例,優(yōu)化了一步純化和固定化的條件。

注:虛線框為固定化后微球的組成模擬圖。

2.6.1 一步純化固定化的最優(yōu)溫度

SpyTag/SpyCatcher肽鍵的形成會受溫度的影響。研究了不同溫度下ST-treY和固定化載體的固定化速率。從圖9a中表明,重組酶的固定化速率隨著溫度的升高而提高,在25 ℃時達(dá)到最高固定化率58.7%,60 ℃時重組酶的固定化率下降至32.5%。所以一步純化固定化的最優(yōu)溫度為25 ℃。

2.6.2 一步純化固定化的最優(yōu)pH

在SpyTag/SpyCatcher之間異肽鍵形成過程中,pH影響氨基酸的解離狀態(tài),從而影響肽鍵形成的穩(wěn)定性[24]。在最佳溫度下,對不同pH環(huán)境下的固定化速率進(jìn)行了研究。如圖9b所示,pH過高或過低時,都會影響固定效率,當(dāng)pH分別為5.0、6.0和7.4時,固定化率普遍較高,分別為60.4%、59.8%和63.2%。因此,一步純化固定化的最優(yōu)pH為7.4。

2.6.3 一步純化固定化的最佳載體添加量

SpyTag/SpyCatcher形成肽鍵的理論比例為1∶1[4]。在最優(yōu)溫度和pH條件下,通過加入10～20 μmol的SC-CBM固定化載體,對固定化載體的添加量進(jìn)行了優(yōu)化。如圖9c所示,隨著載體添加量的增加,固定化率逐漸上升,但當(dāng)添加量大于13 μmol時趨于穩(wěn)定,固定化率達(dá)77.4%。因此作用酶與固定化載體的最佳配比為1.0∶1.3,高于理論值。造成這種偏差的原因可能是由于在固定化載體的制備中使用了戊二醛交聯(lián)而破壞了SpyCatcher部分空間結(jié)構(gòu),從而加大了固定化載體的添加量。

2.6.4 一步純化固定化的最優(yōu)作用時間

固定化時間的長短也會影響固定化效果?；谝陨涎芯?探討了不同的固定化時間。如圖9d所示,固定時間為1～20 min時,固定化速率逐漸增長,但一旦超過20 min就基本穩(wěn)定,所以一步純化固定化的最優(yōu)作用時間為20 min,此時固定化率76.8%。

圖9 一步純化固定化條件優(yōu)化

2.6.5 粗酶液中的一步純化固定化

通過多次平行實(shí)驗發(fā)現(xiàn),ST-treY和ST-treZ最佳發(fā)酵條件相同。當(dāng)生長量OD600在1.5～2.0時,ST-treY和ST-treZ酶活達(dá)最高約為(6.3±2.3)和(8.4±1.5) U/mL；在最佳生長量條件下,IPTG添加量為0.2 mmol/L時,ST-treY和ST-treZ酶活達(dá)最高約為(8.5±3.7)和(10.2±2.4) U/mL；基于以上條件,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時,ST-treY和ST-treZ酶活為(9.6±1.6)和(13.3±3.1) U/mL；最后確定誘導(dǎo)時間為16 h時,ST-treY和ST-treZ酶活最高為(11.2±0.7)和(16.9±2.3) U/mL。依據(jù)最佳發(fā)酵條件來制取粗酶液,將優(yōu)化后的固定化條件應(yīng)用于粗酶液中,實(shí)現(xiàn)粗酶液中ST-treY和ST-treZ的純化及固定化。當(dāng)作用時間為1～40 min時,ST-treY和ST-treZ在粗酶液中的固定化率逐漸增加,40 min后趨于穩(wěn)定。此刻,ST-treY和ST-treZ在粗酶液中的一步純化固定化率分別為69.6%和68.4%。

3 結(jié) 論

實(shí)驗成功的將SpyTag/SpyCatcher應(yīng)用于固定化系統(tǒng)中,并對它們之間的相互作用以及一步純化固定化條件進(jìn)行了研究與優(yōu)化,固定化載體可以直接從發(fā)酵液或細(xì)胞裂解液中完成作用酶的固定,使固定化率能夠達(dá)到69.6%和68.4%。顯示了利用SpyTag/SpyCatcher的固定化技術(shù)在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中的可行性,而且僅需融合SpyTag標(biāo)簽就能夠獲得一個通用的固定化載體,還不會改變作用酶的酶學(xué)性質(zhì)。使用SpyTag/SpyCatcher為媒介,可大大減少酶的浪費(fèi)和生產(chǎn)成本。未來,基于SpyTag/SpyCatcher的固定化技術(shù)也將在生物學(xué)、食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有一定的研究和應(yīng)用價值。