許驍 李澤衍 周雨揚 聶鸝慶 江洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心臟自主神經(jīng)研究中心 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060)

中國的心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)發(fā)病率正逐年升高，2016年中國有近400萬人死于CVD[1]。根據(jù)全球疾病負擔(dān)研究[2]，高血壓、高血脂、吸煙、高體重指數(shù)和高空腹血糖等CVD傳統(tǒng)危險因素每年可導(dǎo)致50萬～200萬人死于CVD。除了傳統(tǒng)危險因素，負面情緒狀態(tài)在CVD的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用[3]。已有大量研究[4]表明，抑郁、焦慮等負面情緒可通過影響自主神經(jīng)系統(tǒng)、誘發(fā)炎癥反應(yīng)和改變血管內(nèi)皮功能等途徑增加心肌梗死(myocardial infarction，MI)的發(fā)生風(fēng)險。

下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus，VMH)是下丘腦的亞核，也是大腦中調(diào)控能量代謝和情緒的關(guān)鍵腦區(qū)[5-6]。有研究[6-7]表明，VMH與抑郁、焦慮和驚恐等情緒的產(chǎn)生相關(guān)。另有文獻表明，VMH可調(diào)控自主神經(jīng)系統(tǒng)，激活VMH可增加交感神經(jīng)活性[8-10]，而交感神經(jīng)過度激活可誘發(fā)室性心律失常及心源性猝死[11]。然而，鮮有文獻記載VMH活性與心律失常間的直接關(guān)系。

本研究旨在探討化學(xué)遺傳激活VMH后對大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心臟電活動的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

15只雄性健康Sprague-Dawley大鼠(220～250 g)均由武漢大學(xué)動物實驗中心提供。所有動物都飼養(yǎng)在12 h光照-黑暗循環(huán)下溫度可控的環(huán)境中[溫度(24±2)℃]。對所有動物進行7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，完全隨機分為對照組、MI組和激活組，每組5只。所有實驗步驟均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物福利倫理委員會批準。

1.2 VMH化學(xué)遺傳激活

MI組和激活組大鼠在禁食12 h后以40 mg/kg體重經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉。大鼠麻醉后俯臥位固定于大鼠立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，在頭皮上沿正中線開口充分暴露顱骨。參考Paxinos & Watson大鼠腦圖譜，以前囟為坐標原點定位大鼠VMH(前后：前囟后2.85 mm；旁開：中縫外側(cè)0.6 mm；深度：顱骨表面以下9.0 mm)。使用10 μL Hamilton注射器，以20 nL/min的速度將100 nL腺相關(guān)激活病毒[rAAV-hSyn-hM3d(Gq)-EGFP-WPRE-pA2/2，武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司]注射至激活組大鼠雙側(cè)VMH。MI組以相同速度、體積注射腺相關(guān)空載病毒(rAAV-hSyn-EGFP-WPRE-pA2/2，武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司)。注射完成后，注射器在原位置停留5 min，然后緩慢拔出。病毒注射3周后，所有大鼠均接受3.3 mg/kg體重濃度氯氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide ，CNO)(武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司)腹腔注射，持續(xù)2周。

1.3 AMI模型建立

MI組和激活組大鼠在CNO腹腔注射2周后，建立AMI模型。予術(shù)前禁食12 h，以40 mg/kg濃度腹腔注射2%戊巴比妥鈉實施麻醉。以仰臥位固定于實驗臺上，連接至小動物呼吸機予以正壓通氣。經(jīng)左前胸暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動脈造成MI。觀察大鼠心電圖ST段變化及心肌組織顏色變化。心電圖出現(xiàn)ST段抬高及心肌組織由紅色變?yōu)榘咨暈樵炷３晒?。對照組大鼠經(jīng)左前胸暴露心臟后關(guān)閉胸腔，不結(jié)扎冠狀動脈。

1.4 體表心電圖記錄

MI造模后1 d，對大鼠進行體表心電圖測量。40 mg/kg體重腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉。頸部和胸前區(qū)備皮消毒，仰臥位固定于操作臺，行氣管插管術(shù)并連接呼吸機正壓通氣，大鼠四肢用針刺電極連接Powerlab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄心電圖，利用Labchart 8.0分析PR間期、QRS波群時限和QT間期以及心率變異性頻域指標[低頻功率(low frequency，LF)、高頻功率(high frequency，HF)及LF/HF比值]。

1.5 有效不應(yīng)期

經(jīng)左前胸暴露心臟，在以下心外膜部位測量心室有效不應(yīng)期(effective refractory period，ERP)：左心室心尖部(left ventricular apex，LVA)、左心室心底部(left ventricular base，LVB)和左心室心中部(the median area of left ventricle，LVM)。用Powerlab可編程多通道刺激器對上述部位進行程序電刺激。程序電刺激由8個連續(xù)周長為100 ms的S1S1刺激外加1個S2刺激組成，S1S2間期從100 ms開始，以10 ms遞減，接近ERP時以2 ms遞減，直至達到ERP。ERP定義為不能奪獲心室的最長S1S2間期。

1.6 免疫熒光

取材，將腦組織快速取下，浸泡在多聚甲醛中固定。脫水后使用冰凍切片機取VMH腦區(qū)5 μm冠狀面冰凍切片，冰凍切片37 ℃烘箱烘烤10 min，控干水分。置于4%多聚甲醛固定30 min，于磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。再將組織切片置于盛滿乙二胺四乙酸抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。自然冷卻后將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈，甩干PBS，滴加牛血清白蛋白，封閉30 min后甩掉封閉液，在切片上滴加c-fos一抗(GB11069，武漢賽維爾生物科技有限公司)，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。而后將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。再將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液，避光室溫孵育10 min。再將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。最后在顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。采用GraphPad 9.0進行統(tǒng)計學(xué)分析與作圖。先對所有計量數(shù)據(jù)進行Kolmogorov-Smirnov檢驗以明確是否符合正態(tài)分布。兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗分析。將P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)遺傳激活VMH

MI組和激活組大鼠經(jīng)化學(xué)遺傳病毒及CNO注射后，VMH腦區(qū)可見攜帶綠色熒光蛋白的病毒表達(圖1)。對三組大鼠VMH神經(jīng)元活性進行比較，發(fā)現(xiàn)MI組和激活組VMH c-fos表達量均顯著高于對照組，且激活組VMH 神經(jīng)元活性顯著高于MI組(c-fos標準化計數(shù)，激活組vs MI組：25.39±5.16 vs 18.76±3.52，P<0.05)(圖2A和圖2B)，結(jié)果提示VMH被化學(xué)遺傳激活，且激活組VMH神經(jīng)元活性顯著升高。

注:左圖為100 μm視野下轉(zhuǎn)染化學(xué)遺傳病毒rAAV-hSyn-hM3d(Gq)-EGFP-WPRE-pA2/2后局部腦區(qū)增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)熒光圖,白色橢圓虛線為VMH;右圖為20 μm視野下轉(zhuǎn)染化學(xué)遺傳病毒rAAV-hSyn-hM3d(Gq)-EGFP-WPRE-pA2/2后局部腦區(qū)EGFP熒光圖,白色箭頭所指為轉(zhuǎn)染化學(xué)遺傳病毒后表達EGFP的神經(jīng)細胞。圖1 VMH中化學(xué)遺傳病毒表達情況

注:A為50 μm視野下各組VMH c-fos表達情況。Merge為熒光圖疊加(c-fos+DAPI)。B為各組VMH中c-fos陽性細胞標準化計數(shù)。與對照組相比,##表示P<0.01;與MI組相比,*表示P<0.05。圖2 VMH中神經(jīng)元激活情況

2.2 VMH激活改變大鼠心率變異性

對三組大鼠體表心電圖進行測量，分析心率變異性。與對照組相比，MI組與激活組LF升高，HF降低，LF/HF比值升高；與MI組相比，激活組LF升高，HF降低，LF/HF比值升高。上述結(jié)果均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(表1)。對三組大鼠心電圖指標進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MI組PR間期、QRS波群時限升高，但結(jié)果無顯著性差異；MI組QT間期顯著延長(P<0.01)。與MI組相比，激活組PR間期、QRS波群時限和QT間期均顯著升高(P<0.05)(表2)。

表1 三組大鼠心率變異性比較

表2 兩組大鼠心電圖指標比較 單位：ms

2.3 VMH激活降低心室ERP

通過在體電生理實驗技術(shù)測量三組大鼠LVA、LVM、LVB的ERP。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MI組和激活組左心室三個部位ERP均顯著降低，且激活組ERP顯著低于MI組(P<0.05)(表3)。

表3 三組大鼠ERP比較 單位：ms

3 討論

焦慮、憤怒和抑郁等負面情緒與CVD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。有研究[12]表明，抑郁癥會增加MI、心房顫動和心源性猝死的發(fā)生率。而Roest等[13]的meta分析納入249 846例冠心病患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)焦慮與冠狀動脈疾病以及心源性猝死風(fēng)險增加有關(guān)。

情緒相關(guān)核團及腦區(qū)在調(diào)節(jié)外周各器官生理活動中起到重要作用。在大腦中，情緒相關(guān)核團或腦區(qū)包括額葉皮層、下丘腦和杏仁核等，而這些核團可對心血管系統(tǒng)起調(diào)節(jié)作用[14]。Ruiz Vargas等[15]的meta分析顯示，利用神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)可有效分析神經(jīng)核團的活性，而前額葉皮層的活性與心率、心率變異性正相關(guān)。而Chen等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制下丘腦室旁核中活化的星形膠質(zhì)細胞可減少AMI大鼠室性心律失常的發(fā)生，改善心室電活動紊亂。

VMH是下丘腦的亞核，參與各種體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，例如負面情緒、骨骼穩(wěn)態(tài)、糖代謝和能量代謝[17-18]，此外，VMH也是調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵腦區(qū)，激活VMH可增加交感神經(jīng)活性[8-10]，而交感神經(jīng)的過度激活與心律失常的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。早期研究表明，交感神經(jīng)激活引起心電圖復(fù)極化改變和顫動閾值降低，促進心室顫動的發(fā)生[20]，而這些效應(yīng)在心肌缺血的狀態(tài)下被放大[21]。James等[22]的影像學(xué)研究顯示，VMH活性升高與血壓、心率上升具有顯著相關(guān)性，但目前并無VMH激活誘發(fā)惡性心律失常的證據(jù)。

為了特異性激活VMH，本研究采用化學(xué)遺傳技術(shù)，激活VMH神經(jīng)元上通過腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染的激活型受體hM3Dq，實現(xiàn)精確調(diào)控。Coutinho等[23]曾通過該方法特異性激活VMH，發(fā)現(xiàn)VMH激活可增加外周胰島素敏感性。而Dyavanapalli等[24]也通過化學(xué)遺傳特異性激活心內(nèi)膽堿能神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)心功能障礙得到改善。本實驗中，通過化學(xué)遺傳特異性激活VMH。免疫熒光結(jié)果顯示，激活組VMH腦區(qū)中c-fos表達水平較對照組顯著上升，提示VMH神經(jīng)元被成功激活。

在本研究中，通過在體心電圖檢查發(fā)現(xiàn)，激活VMH后，AMI大鼠LF顯著升高，HF降低，LF/HF升高。LF主要反映交感神經(jīng)功能，而HF主要反映迷走神經(jīng)功能[25]。已有研究[26]表明，交感神經(jīng)過度激活可引起心肌缺血后電生理紊亂，從而促進惡性心律失常的發(fā)生。此外，與對照組相比，激活組PR間期、QRS波群時限和QT間期均顯著延長。PR間期是反映房室傳導(dǎo)的重要指標。大型隊列研究結(jié)果表明，PR間期延長與房性及室性心律失常、心力衰竭和死亡風(fēng)險增加有關(guān)[27]。PR間期延長是心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)的標志，也是心臟自主神經(jīng)功能紊亂的標志[27-29]。QT間期反映房室結(jié)至心室的電傳導(dǎo)速度，是心室電活動的評價指標。QT間期與自主神經(jīng)功能聯(lián)系緊密。研究[30]顯示，在交感神經(jīng)張力升高或副交感神經(jīng)張力降低的情況下，QT間期延長，而QT間期延長與心肌缺血、惡性室性心律失常密切相關(guān)。根據(jù)上述研究結(jié)果可推測，VMH激活可導(dǎo)致交感神經(jīng)過度激活，從而引起PR間期、QT間期延長，引起心臟電活動紊亂，而激活組ERP的縮短進一步驗證了VMH激活對心臟電活動的影響。

雖然VMH活性與惡性心律失常的關(guān)系以及內(nèi)在機制尚不明確，但本研究結(jié)果初步提示，VMH激活可能通過交感神經(jīng)引起心臟電活動紊亂。這為MI、心律失?；颊叩那榫w管理重要性提供了一定的依據(jù)，也為CVD患者特別是合并不良情緒的患者提供了治療方向。未來需進一步研究VMH激活誘發(fā)惡性心律失常的具體神經(jīng)通路及分子機制。