高振華，侯書鵬

糖尿病心肌病是糖尿病病人常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，也是導(dǎo)致糖尿病病人死亡的主要原因之一。心肌纖維化是糖尿病心肌病早期組織病理學(xué)改變，且呈進(jìn)行性加重，是導(dǎo)致心臟功能惡化的重要因素，表現(xiàn)為心室舒張和收縮功能障礙，泵血功能降低，逐漸發(fā)展為充血性心力衰竭[1]。因此，抑制心肌纖維化是糖尿病心肌病防治的重要靶點(diǎn)。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B)是銀杏葉的主要活性成分之一，具有拮抗血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的作用[2]。相關(guān)研究顯示，銀杏內(nèi)酯B對(duì)肝纖維化及高血壓所致心肌纖維化具有明顯的抑制作用[3-4]，銀杏內(nèi)酯B通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)通路抑制腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[5]。本研究探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的抑制作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體重180～220 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-004]，清潔環(huán)境分籠飼養(yǎng)，室溫23～25℃，相對(duì)濕度50%～60%，明暗照射各12 h，適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后開展實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 銀杏內(nèi)酯B(純度>95%)購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒和蘇木精-伊紅(HE)、天狼猩紅染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7、β-actin抗體和IgG二抗購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 OneTouch Ⅱ型血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；Vevo2100型小動(dòng)物超聲儀(加拿大Visual Sonics公司)；LX-20型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)；TB718型石蠟包埋機(jī)(湖北泰維醫(yī)療科技有限公司)；RM2245型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；DYCZ-40D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳槽(北京六一儀器廠)；DS-5M-L1型光學(xué)顯微鏡(日本尼康儀器有限公司)。高糖高脂飼料配制：基礎(chǔ)飼料67.5%，蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2.5%。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 糖尿病大鼠模型制備、分組與給藥 將50只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、銀杏內(nèi)脂B(GB)低劑量組、GB中劑量組和GB高劑量組，每組10只。正常對(duì)照組大鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。其余各組大鼠參照沈豪等[6]報(bào)道方法，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，以35 mg/kg劑量腹腔注射1%的STZ制備糖尿病大鼠模型。造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：注射STZ后24 h、72 h，空腹血糖≥16.7 mmol/L。給藥：正常對(duì)照組和模型組每日1次腹腔注射生理鹽水5 mL/kg，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組每日1次腹腔注射6 mg/mL、12 mg/mL、24 mg/mL銀杏內(nèi)酯B溶液5 mL/kg，療程均為12周。

1.4.2 心功能指標(biāo)測(cè)定 末次給藥24 h后，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉后，采用小動(dòng)物超聲系統(tǒng)取左心室長(zhǎng)軸切面，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，并計(jì)算左室短軸縮短率(LVFS)，LVFS(%)=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100%，連續(xù)測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.4.3 血清AST、LDH、CK-MB含量測(cè)定 由腹主動(dòng)脈取血，2 500 r/min離心，離心半徑10 cm，5 min后取血清，采用生化分析儀測(cè)定AST、LDH、CK-MB含量。

1.4.4 HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變 脊椎脫臼處死大鼠后開胸取心臟，取部分左心室心肌組織置于4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片，取部分石蠟切片按照試劑盒操作說(shuō)明行常規(guī)HE染色，中性樹脂封片后采用顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)改變。

1.4.5 天狼猩紅染色法觀察心肌組織病理學(xué)改變 取其余心肌組織石蠟切片，按照試劑盒操作說(shuō)明行天狼猩紅染色，中性樹脂封片后采用顯微鏡觀察各組大鼠心肌間質(zhì)區(qū)和血管壁周圍纖維化狀況。每張切片取5個(gè)不重疊的視野，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，CVF(%)=(膠原面積/視野總面積)×100%。

1.4.6 蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測(cè)心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá) 每只大鼠取50 g左心室心肌組織，加入1 mL裂解液于冰上研磨勻漿，靜置30 min使其充分裂解，取裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心，離心半徑10 cm，20 min后取上清液，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，取30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、濕法轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加TGF-β1(1∶800稀釋)、p-Smad2/3(1∶1 000稀釋)、Smad7(1∶1 000稀釋)、GAPDH(1∶1 500稀釋)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加IgG(1∶3 000稀釋)二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB顯色，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算條帶灰度值，根據(jù)條帶灰度值以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD升高，LVEF、LVFS降低(P<0.01)；與模型組比較，GB中劑量組、GB高劑量組LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高(P<0.05或P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB高劑量組LVEDD、LVESD降低，LVFS明顯升高(P<0.05或P<0.01)；GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組LVEF比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GB中劑量組與GB低劑量組、GB高劑量組LVEDD、LVESD、LVFS比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量升高(P<0.01)；與模型組比較，GB中劑量組、GB高劑量組AST、LDH、CK-MB含量降低(P<0.05或P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB高劑量組AST、LDH、CK-MB含量降低(P<0.01)；GB中劑量組與GB低劑量組、GB高劑量組AST、LDH、CK-MB含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量比較(±s) 單位：U/L

2.3 銀杏內(nèi)酯B對(duì)糖尿病大鼠心肌組織病理學(xué)改變的影響 正常對(duì)照組大鼠心肌纖維排列有序，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊；模型組大鼠可見(jiàn)心肌纖維斷裂，排列紊亂，心肌細(xì)胞核固縮深染，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變；與模型組比較，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組大鼠心肌組織病理學(xué)改變呈劑量依賴性減輕，其中GB高劑量組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞形態(tài)基本正常，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色圖(×200)

2.4 銀杏內(nèi)酯B對(duì)糖尿病大鼠心肌間質(zhì)和血管壁周圍纖維化的影響 正常對(duì)照組大鼠心肌間質(zhì)和血管壁周圍膠原沉積較少，呈細(xì)紋狀、均勻分布；模型組大鼠心肌間質(zhì)區(qū)和血管壁周圍膠原沉積明顯增多，膠原條紋增粗、分布不均勻；與模型組比較，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組大鼠心肌間質(zhì)和血管壁周圍膠原沉積呈現(xiàn)劑量依賴性減少。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌間質(zhì)和血管壁周圍CVF均升高(P<0.01)；與模型組比較，GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組大鼠心肌間質(zhì)區(qū)和血管壁周圍CVF均降低(P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB中劑量組、GB高劑量組心肌間質(zhì)和血管壁周圍CVF均降低(P<0.01)；與GB中劑量組比較，GB高劑量組心肌間質(zhì)和血管壁周圍CVF均降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2、圖3、表3。

圖2 各組大鼠心肌間質(zhì)纖維化天狼猩紅染色圖(×200)

圖3 各組大鼠血管壁周圍纖維化天狼猩紅染色圖(×200)

表3 各組大鼠心肌間質(zhì)和血管壁周圍CVF比較(±s) 單位：%

2.5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)上調(diào)，Smad7表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，GB中劑量組、GB高劑量組TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)下調(diào)，Smad7表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與GB低劑量組比較，GB中劑量組、GB高劑量組TGF-β1表達(dá)下調(diào)，Smad7表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，GB高劑量組p-Smad2/3表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；GB中劑量組與GB低劑量組p-Smad2/3表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與GB中劑量組比較，GB高劑量組TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)下調(diào)，Smad7表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。詳見(jiàn)圖4、表4。

圖4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)條帶圖(A為正常對(duì)照組；B為模型組；C為GB低劑量組；D為GB中劑量組；E為GB高劑量組)

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

3 討 論

高血糖所致心肌纖維化為糖尿病心肌病的主要病理機(jī)制，也是導(dǎo)致心臟功能降低、心臟器質(zhì)性病變和糖尿病病人死亡的重要因素之一[7-8]。因此，以抑制心肌纖維化為靶點(diǎn)進(jìn)行治療對(duì)延緩糖尿病心肌病進(jìn)展至關(guān)重要。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，病機(jī)為氣陰兩虛，病程持久致陰損及陽(yáng)、脾腎陽(yáng)虛、水濕潴留、瘀血濁毒內(nèi)停[9]。董麗等[10-11]研究顯示，益氣活血方能降糖調(diào)脂，對(duì)心功能具有保護(hù)作用。銀杏是我國(guó)獨(dú)有的一種中生代孑遺植物，銀杏果和銀杏葉為傳統(tǒng)中藥品種。其中銀杏葉性平、味苦澀，歸心、肺經(jīng)，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、化濁降脂之功效。銀杏葉主要活性成分銀杏內(nèi)酯B屬萜類內(nèi)酯化合物，具有抑制血小板活化、抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物學(xué)活性[12]，近年來(lái)其抗纖維化作用逐漸受到關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，銀杏內(nèi)酯B治療12周能改善糖尿病大鼠心臟功能(降低LVEDD、LVESD，提高LVEF、LVFS)，降低血清AST、LDH、CK-MB含量，減輕心肌組織病理學(xué)改變及心肌間質(zhì)和血管壁周圍纖維化，且呈一定的劑量依賴性。

組織纖維化過(guò)程有多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等參與調(diào)控，其中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)的TGF-β1促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)表達(dá)與沉積，在心肌組織纖維化中發(fā)揮著重要的作用[13]。TGF-β1/Smads信號(hào)通路在組織纖維化過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用[14]，Smads家族蛋白是TGF-β1的下游靶分子，其中Smad2、Smad3可被TGF-β1誘導(dǎo)磷酸化后結(jié)合生成二聚體p-Smad2/3，p-Smad2/3核轉(zhuǎn)位后與相關(guān)基因結(jié)合促進(jìn)ECM轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；Smad7與TGF-β1受體結(jié)合，發(fā)揮抑制纖維化的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，給予銀杏內(nèi)酯B治療12周，能下調(diào)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)并上調(diào)Smad7表達(dá)，且銀杏內(nèi)酯B呈一定的劑量依賴性，提示銀杏內(nèi)酯B對(duì)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1/Smads信號(hào)通路具有調(diào)控作用。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B對(duì)糖尿病大鼠心臟具有保護(hù)作用，可能與調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路，抑制心肌纖維化有關(guān)，可為銀杏內(nèi)酯B作為糖尿病所致心肌纖維化防治候選藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。