田騰輝，鄧 悅，Tumurkhuyag Atartsetseg，常立萍，石 銳，于克英，張 淼

近年來，隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)改變，人們罹患心血管疾病的危險因素不斷增加，導(dǎo)致冠心病發(fā)病率和死亡率逐年升高，已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要疾病之一[1]。經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)為冠心病病人帶來福音，是目前防治心血管疾病的重要手段[2]。新一代藥物洗脫支架(DES)的應(yīng)用極大地降低了急性心血管事件死亡率，但晚期支架衰竭是關(guān)注的焦點問題。有研究顯示，支架內(nèi)新生動脈粥樣硬化是導(dǎo)致晚期血管再狹窄的重要因素[3]，且與血管內(nèi)膜中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-凋亡機制密切相關(guān)[4-5]。中醫(yī)藥在再狹窄的治療中發(fā)揮著重要作用[6-7]，在心血管疾病領(lǐng)域中具有廣闊的研究前景和挖掘潛力?；硖到舛就ńj(luò)飲是鄧悅教授基于“痰瘀伏絡(luò)”學(xué)說研制的中藥方劑，多項研究表明豁痰解毒通絡(luò)飲有確切的臨床療效[8-9]。本研究探討豁痰解毒通絡(luò)飲在再狹窄形成過程中的作用機制，為多靶點防治PCI術(shù)后再狹窄提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5周齡無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠，350～400 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001，飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。本研究動物實驗經(jīng)過長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核。

1.2 實驗藥物及試劑 豁痰解毒通絡(luò)飲，組方：全瓜蔞20 g，丹參15 g，金銀花30 g，當(dāng)歸15 g，甘松15 g等。中藥由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院新綠色顆粒藥房提供；阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：S90893，國藥準(zhǔn)字：H20051408)；兔源一抗購自Cell Signaling公司；引物序列合成于庫美生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器 7500型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)儀(美國Bio-Rad公司)；M200PRO型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；RM2135 石蠟切片機(德國Leica公司)；FL1000型電化學(xué)發(fā)光(ECL)智能成像儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將24只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、球囊損傷模型組(模型組)、中藥組和西藥組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后行頸動脈球囊損傷術(shù)[10]。西藥組給予阿托伐他汀[1.19 mg/(kg·d)]灌胃，中藥組給予豁痰解毒通絡(luò)方[16.33 g/(kg·d)]灌胃，其余兩組予以等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃4周。

1.4.2 動物模型構(gòu)建 術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，頸部備皮后行頸部正中切口，鈍性分離至左頸總動脈，頸外動脈用眼科剪45°作一V型切口，插入球囊約3 cm，調(diào)整球囊壓力3.0～5.2 atm，將球囊旋轉(zhuǎn)抽出至頸總動脈遠(yuǎn)心端，重復(fù)3次操作，結(jié)扎頸外動脈近心端，無出血后逐層縫合。Sham組僅結(jié)扎頸外動脈。每只大鼠術(shù)后腹腔注射青霉素20×104U預(yù)防感染。

1.4.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 取頸動脈損傷段浸入4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后4 μm切片，經(jīng)HE染色、封片后光鏡下觀察各組大鼠頸總動脈內(nèi)膜增生情況。

1.4.4 免疫組化法實驗 將石蠟包埋切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，通過抗原修復(fù)、封閉后，加入C/EBP同源蛋白(C/EBP homoiogousprotein，CHOP)抗體4 ℃孵育過夜，二抗37℃避光放置35min，使用二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)顯色后蘇木素復(fù)染，并脫水封片。在400倍光鏡下觀察血管CHOP蛋白陽性表達(dá)情況。

1.4.5 蛋白免疫印跡實驗 組織液氮研磨后，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，勻漿后以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒測定。配制10%的十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，設(shè)置恒壓為70 V、30 min，后轉(zhuǎn)為140 V、35 min。聚偏氟乙烯(PVDF)膜于5%脫脂奶粉中封閉1.5 h，一抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)孵育2 h，每個步驟間均以磷酸鹽緩沖液(PBST)洗脫5次，每次5 min。ECL顯色，采用Image J軟件計算灰度值。

1.4.6 RT-qPCR 常規(guī)Trizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR實驗，體系為25 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；PCR擴增條件95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。CHOP引物序列：正向引物為CATGAACTGTTGGCATCACC，反向引物為CTACCCTCAGTCCCCTCCTC；Bax引物序列：正向引物為GAGGACGCATCCACCA，反向引物為GCCTTGAGCACCAGTT；GAPDH引物序列：正向引物為TACCCACGGCAAGTTCAA，反向引物為GCCAGTAGACTCCACGACAT。計算待測樣本基因CT值，相對基因表達(dá)量用2-△△CT表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠頸動脈內(nèi)膜增生情況 Sham組血管形態(tài)完整，內(nèi)皮層形態(tài)完整，內(nèi)皮細(xì)胞單層規(guī)律排列，中膜由均勻連續(xù)的梭形平滑肌細(xì)胞構(gòu)成；與Sham組比較，模型組內(nèi)膜增厚，管腔狹窄；與模型組比較，中藥組及西藥組內(nèi)膜增生情況緩解。詳見圖1。

圖1 各組大鼠頸動脈內(nèi)膜增生HE染色圖(×100)

2.2 各組新生血管內(nèi)膜CHOP蛋白陽性表達(dá)情況 光鏡下，血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞胞核中陽性CHOP表達(dá)呈黃棕色顆粒。與Sham組比較，模型組頸動脈CHOP蛋白表達(dá)量增加；與模型組比較，中藥組和西藥組CHOP蛋白陽性表達(dá)減少。詳見圖2。

圖2 各組大鼠頸總動脈新生內(nèi)膜CHOP蛋白免疫組化圖(×400)

2.3 豁痰解毒通絡(luò)飲對大鼠頸總動脈蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與Sham組比較，模型組頸動脈PERK、CHOP、Bax蛋白表達(dá)水平增加(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平減少(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和西藥組PERK、CHOP、Bax蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。詳見圖3。

與Sham組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖3 各組大鼠頸總動脈PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較(A為各蛋白條帶圖；B為PERK蛋白表達(dá)柱狀圖；C為CHOP蛋白表達(dá)柱狀圖；D為Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)柱狀圖；E為Bcl-2蛋白表達(dá)柱狀圖；F為Bax蛋白表達(dá)柱狀圖。a為Sham組；b為模型組；c為中藥組；d為西藥組)

2.4 各組大鼠頸總動脈CHOP、Bax mRNA表達(dá)比較 與Sham組比較，模型組大鼠頸總動脈CHOP、Bax mRNA表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和西藥組CHOP、Bax mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠頸總動脈CHOP、Bax mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

近年來，PCI在冠心病治療中發(fā)揮著重要作用。在血管動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上，PCI機械損傷和細(xì)胞后疊加作用發(fā)生病理變化，引起并持續(xù)加重術(shù)后管腔再狹窄。再狹窄是造成PCI治療局限的主要因素[11]。目前，再狹窄的研究多從炎癥反應(yīng)、血栓形成、血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡失衡[12]等方面展開，但潛在的機制需進(jìn)一步深入探討。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已成為慢性代謝性疾病的研究熱點問題。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)可能受到多種生理及病理因素影響[13]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)紊亂時，誘導(dǎo)自我保護(hù)機制即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ERS)發(fā)生，其中，未折疊蛋白反應(yīng) (unfolded protein response，UPR)是ERS的主要應(yīng)激途徑。當(dāng)錯誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷積累時，UPR信號通過3種已知的駐留蛋白感知：肌醇需要蛋白1(IRE1)、PERK和激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)。這些壓力傳感器中每一種蛋白激活均誘導(dǎo)一系列的糾正措施緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力，病理情況下，持續(xù)的ERS可誘導(dǎo)1個或多個促凋亡信號通路活化[14]。多項研究表明，ERS可促進(jìn)新內(nèi)膜形成，認(rèn)為是促進(jìn)動脈粥樣硬化形成的相關(guān)因素[15-16]，且ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化斑塊形成中發(fā)揮著重要作用[17]。PERK是ERS的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)子，通過磷酸化α亞基的真核起始因子2(eIF2α)暫時降低蛋白質(zhì)翻譯速度，并糾正翻譯中干擾。磷酸化后eIF2α可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)及CHOP上調(diào)，發(fā)揮多種糾正功能[18]。盡管3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力傳感器均可誘導(dǎo)CHOP，其中以PERK最強烈[19]。CHOP持續(xù)升高可能通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣代謝和Bcl家族成員觸發(fā)凋亡機制[20-21]。Bcl-2家族可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的串?dāng)_，Bax在線粒體膜中被激活并寡聚，從而誘導(dǎo)細(xì)胞色素C和其他凋亡原的釋放引發(fā)凋亡，且抗凋亡成員中Bcl-2轉(zhuǎn)錄下調(diào)機制已在CHOP轉(zhuǎn)染的大鼠成纖維細(xì)胞系和培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中得到了證實[22-23]。有研究表明，Bcl-2基因缺失增加了晚期動脈粥樣硬化病變中巨噬細(xì)胞凋亡，與CHOP介導(dǎo)的Bcl-2下調(diào)促凋亡機制一致[24]。

中醫(yī)學(xué)無PCI術(shù)后再狹窄的病名，將其歸屬于“胸痹”的范疇?；谡w觀和辨證論治指導(dǎo)下的中醫(yī)藥在改善病人臨床癥狀、延緩再狹窄進(jìn)程及提高生存質(zhì)量方面顯示出獨特優(yōu)勢?；硖到舛就ńj(luò)飲是鄧悅教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制出的中藥方劑，認(rèn)為“痰瘀伏絡(luò)、蘊結(jié)成毒”是本病的主要機制。鄧悅教授認(rèn)為，在心血管疾病病程進(jìn)展中，伏邪(伏痰、伏瘀)病理狀態(tài)貫徹始終，“伏邪三期”的提出與PCI術(shù)后再狹窄的疾病內(nèi)涵頗為中的，即冠狀動脈狹窄性疾病的臨床前期多隱匿遷延，是內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)代謝、炎癥等多種生物學(xué)改變的慢性積累過程[25]，多伴有痰瘀互結(jié)、毒損心絡(luò)及正氣耗傷的病機。絡(luò)脈阻塞，日久化熱釀毒，營氣不從，逆于肉理，血敗絡(luò)腐，與西醫(yī)動脈粥樣硬化斑塊破潰出血、炎癥浸潤等一系列病理改變相似；臨床期，斑塊破裂繼發(fā)血栓導(dǎo)致冠狀動脈完全或近乎閉塞，形成本虛而痰、瘀毒蘊結(jié)標(biāo)實的病機[26-27]，此時雖應(yīng)用PCI治療機械性再通血管，然而其內(nèi)在病機未得到改善，反而加重血管損傷，繼發(fā)管腔內(nèi)再狹窄，使疾病進(jìn)入遷延緩解期[28]，如此反復(fù)。因此，抓住“痰瘀伏絡(luò)、蘊結(jié)成毒”的關(guān)鍵病機，以豁痰解毒通絡(luò)為主要治療，可拓寬PCI術(shù)后再狹窄的治療思路，提高臨床療效。

本研究結(jié)果顯示，球囊損傷后28 d，模型組大鼠血管內(nèi)皮較Sham組增生并伴管腔明顯狹窄，提示建模成功。與模型組比較，中藥組血管重構(gòu)情況得到明顯改善，提示豁痰解毒通絡(luò)飲具有抑制損傷血管內(nèi)皮增生，減輕血管狹窄的作用。分子水平檢測結(jié)果可見，豁痰解毒通絡(luò)飲能下調(diào)球囊損傷動脈組織PERK、CHOP和Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)。推測豁痰解毒通絡(luò)飲可能通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中持續(xù)存在的ERS，從而減輕細(xì)胞過度凋亡造成的損傷，以發(fā)揮抑制血管內(nèi)皮增生的作用。Chen等[29]研究顯示，蒲黃總黃酮通過抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途徑降低氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人主動脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡，從而改善斑塊結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。 Yang等[30]研究顯示，醛脫氫酶2可降低PERK-CHOP表達(dá)，并減少Caspase-3活性，可保護(hù)平滑肌細(xì)胞免受ox-LDL誘導(dǎo)的ERS及ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Li等[31]研究顯示，利拉魯肽可明顯降低糖尿病大鼠主動脈組織CHOP、GRP78蛋白表達(dá)及SREBP-1c、FAS mRNA表達(dá)，從而減輕糖尿病性動脈粥樣硬化發(fā)生。

綜上所述，CHOP在ERS誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮著重要作用，抑制ERS-凋亡途徑的激活對動脈粥樣硬化性疾病是有益的。既往研究多在細(xì)胞水平驗證，同時關(guān)于CHOP下游的凋亡信號研究較少。本研究以大鼠頸動脈球囊損傷為模型，對ERS關(guān)鍵信號進(jìn)行驗證，同時分析Bax和Bcl-2這對拮抗因子的變化，所得結(jié)論與既往研究基本一致，補充和完善了豁痰解毒通絡(luò)飲的作用機制。豁痰解毒通絡(luò)飲具有多成分、多途徑、多靶點的特點，今后仍需進(jìn)一步探討其作用機制。