(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266003)

癲癇是一種由神經(jīng)元異常、同步、過度放電導(dǎo)致的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。癲癇病因復(fù)雜且發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞程序性死亡是癲癇的發(fā)病機(jī)制之一[2-4]。鐵死亡是近幾年提出來的由鐵依賴性的氧化應(yīng)激引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式[5-6]，在動物模型中已經(jīng)證實(shí)鐵死亡與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)[7-9],但其參與癲癇的具體分子機(jī)制尚不明確。丙戊酸鈉(VPA)是經(jīng)典的抗癲癇藥物之一，其作用機(jī)制主要是通過阻滯鈉離子通道以及增強(qiáng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)而發(fā)揮作用。相關(guān)研究表明VPA可通過抑制氧化應(yīng)激途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10-12]，因此VPA可能通過抑制鐵死亡發(fā)揮抗癲癇作用。目前尚未有研究揭示VPA抑制癲癇發(fā)作是否與鐵死亡有關(guān)，因此本研究通過構(gòu)建無鎂誘導(dǎo)的癲癇細(xì)胞模型，在細(xì)胞層面探討鐵死亡參與癲癇的發(fā)生機(jī)制，為VPA藥理機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持，同時也為癲癇藥物的研發(fā)提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料來源

VPA(美國Sigma公司)；?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)、溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7a11)、微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)以及谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)單克隆抗體(美國Abcom公司)，β-actin抗體(美國Protein tech公司)，谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，鐵離子比色分析試劑盒(美國Bio Vison公司)，CCK-8檢測試劑盒(蘇州新賽美生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)與鑒定 選擇以孕19～20 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠的胎鼠為細(xì)胞源。引頸處死SD孕鼠后，取出胎鼠，剪斷其大腦并取其海馬組織，用Neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞最終濃度為1×109個/L,接種于預(yù)先包被過的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，3 d半量換液一次。培養(yǎng)至第7天,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

原代海馬神經(jīng)元接種于裝有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，7 d后進(jìn)行鑒定。將培養(yǎng)在蓋玻片上的細(xì)胞以40 g/L多聚甲醛固定10 min，以含體積分?jǐn)?shù)0.003 Triton-100溶液破膜10 min，以含體積分?jǐn)?shù)0.03牛血清白蛋白溶液封閉1 h。加入一抗MAP-2抗體(1∶500)于4 ℃孵育過夜，然后加二抗山羊抗體IgG抗體室溫避光孵育1 h。用含DAPI染料的抗熒光衰減封片劑進(jìn)行封片后，熒光顯微鏡下采集圖像，檢測原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)，確定海馬神經(jīng)元的純度、狀態(tài)。

1.2.2癲癇細(xì)胞模型的制備與實(shí)驗(yàn)分組 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分組。分別將培養(yǎng)液更換為1.5 mL的正常培養(yǎng)液(A組)、等量的無鎂+0.5 mmol/L VPA溶液(B組)、等量的無鎂細(xì)胞外液(C組)，培養(yǎng)3 h后，立刻用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活性 A～C組按上述方法處理后，分別加入配制好的CCK-8檢測液，避光孵育3 h。用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度后，根據(jù)吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的細(xì)胞活性。

1.2.4比色法檢測各組細(xì)胞中GSH含量 A～C組按上述方法處理后，去上清液，PBS洗1次，用1.5 mL離心管收集各組細(xì)胞。12 000 r/min離心15 min，去上清液，加入細(xì)胞體積3倍的蛋白去除試劑M溶液。每組均分成2部分：一部分樣品加入GSH清除液用于GSSG檢測,另一部分樣品(不加入GSH清除液)用于總GSH檢測。然后這兩部分樣品均加入總GSH檢測工作液，室溫孵育5 min。加入0.5 g/L NADPH溶液，室溫孵育25 min,用酶標(biāo)儀測定波長412 nm處的吸光度。根據(jù)吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總GSH和GSSG的含量，GSH的含量計(jì)算方法：GSH=總GSH-2×GSSG。

1.2.5比色法檢測各組細(xì)胞中鐵離子含量 A～C組細(xì)胞按上述方法處理后，去上清液。PBS洗1次，加入40 μL鐵測定緩沖液5 min后收集細(xì)胞，以12 000 r/min離心15 min。取上清液，加入96孔板中，用鐵測定緩沖液補(bǔ)齊體積至100 μL，再加入5 μL鐵離子還原劑，于37 ℃孵育30 min。后加入100 μL鐵離子探測液，37 ℃避光孵育60 min，用酶標(biāo)儀測定波長593 nm處的吸光度。根據(jù)吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中鐵離子含量。

1.2.6比色法檢測各組細(xì)胞中MDA含量 A～C組細(xì)胞按上述方法處理后，去上清液，加入150 μL PBS制作細(xì)胞勻漿液。取細(xì)胞勻漿液，BCA法檢測A～C組蛋白濃度，以12 000 r/min離心15 min。棄上清液，加入MDA檢測工作液，100 ℃金屬浴加熱30 min,冷卻至室溫。12 000 r/min離心15 min，取上清液200 μL加入96孔板中，以酶標(biāo)儀測定波長532 nm處的吸光度。根據(jù)吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中MDA含量。

1.2.7Western blot方法檢測各組細(xì)胞中ACSL4、SLC7a11和Gpx4蛋白的表達(dá) A～C組細(xì)胞按上述方法處理后，去上清液，加入150 μL PBS制作細(xì)胞勻漿液。取A～C組細(xì)胞的勻漿液，冰上提取蛋白，BCA法檢測各組蛋白總濃度，調(diào)整蛋白濃度為1 g/L。取15 μg蛋白于120 g/L SDS-PAGE凝膠上電泳。取電泳條帶，在200 mA電流下轉(zhuǎn)移至聚乙二烯二氟化物(PDVF)膜中。使用50 g/L脫脂牛奶在37 ℃下封閉1 h，并分別置于anti-ACSL4(1∶5 000)、anti-SLC7a11(1∶1 000)、anti-Gpx4(1∶1 000)、anti-β-actin(1∶8 000)抗體中4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，重復(fù)洗膜步驟，用顯影液顯色。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 原代海馬神經(jīng)元的鑒定

原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，熒光顯微鏡觀察顯示，MAP-2在神經(jīng)元的細(xì)胞體和樹突中表達(dá)(圖1A、B)，海馬神經(jīng)元胞體飽滿，神經(jīng)元突起延伸，相互交織形成復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。DAPI在神經(jīng)元細(xì)胞核中表達(dá)(圖1C、D)，海馬神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)呈橢圓形。合圖后根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、MAP-2的表達(dá)，可鑒定該細(xì)胞為海馬神經(jīng)元，其形態(tài)正常、狀態(tài)良好、純度高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1E、F)。

2.2 VPA對癲癇樣放電海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活性和鐵死亡相關(guān)因子的影響

A～C組癲癇樣放電海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活性、GSH含量以及SLC7a11、Gpx4蛋白相對表達(dá)水平比較差異有顯著性(F=9.844～262.900,P<0.05)，其中C組上述指標(biāo)較A組顯著降低(q=5.992～19.480,P<0.05)；B組上述指標(biāo)較C組顯著升高(q=4.610～32.190,P<0.05)。A～C組原代海馬神經(jīng)元ACSL4蛋白表達(dá)及MDA、鐵離子含量比較差異均有顯著意義(F=16.050～81.770,P<0.05)；其中C組上述指標(biāo)較A組顯著升高(q=7.150～14.540,P<0.05)；B組上述指標(biāo)較C組顯著降低(q=4.991～16.580,P<0.05)。見表1、圖2。

A:MAP-2免疫熒光標(biāo)記神經(jīng)元，100倍；B:MAP-2免疫熒光標(biāo)記神經(jīng)元，200倍；C:DAPI免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞核，100倍；D：DAPI免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞核，200倍；E：A和C的合圖；F：B和D的合圖圖1 原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)觀察Fig.1 Morphology of primary hippocampal neurons

表1 VPA對癲癇樣放電海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性和鐵死亡相關(guān)因子的影響Tab.1 The effect of VPA on cell viability and ferroptosis-related factors in hippocampal neurons with epileptiform discharge

A～C分別代表A～C組圖2 各組海馬神經(jīng)元ACSL4、SLC7a11和Gpx4蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression of ACSL4, SLC7a11, and Gpx4 in each group of hippocampal neurons

3 討 論

大腦中神經(jīng)元興奮性異常增加及過度同步化放電是癲癇發(fā)病的基礎(chǔ)。神經(jīng)元的異常放電會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能紊亂也參與了癲癇的病理過程[14-15]，會導(dǎo)致ROS大量蓄積并造成神經(jīng)元的氧化損傷和死亡[16]，加重癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度和發(fā)作頻率[3]。因此神經(jīng)元的死亡在癲癇發(fā)展中起重要作用。

鐵死亡是由DIXON等[5]于2012年首次命名的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，其發(fā)病機(jī)制主要與鐵代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化物累積相關(guān)[17]，細(xì)胞內(nèi)鐵超載可誘發(fā)芬頓反應(yīng)[18]，產(chǎn)生大量ROS，在ACSL4、脂氧合酶和環(huán)氧合酶(PIGS)的作用下將多聚不飽和脂肪酸氧化成氧化型磷脂酰乙醇胺[19-21]，誘發(fā)鐵死亡的發(fā)生。此外，Gpx4、GSH和胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(system Xc-)組成重要的抗氧化系統(tǒng)，清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，其作用機(jī)制是：system Xc-將胞外的胱氨酸輸運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)與谷氨酸反應(yīng)生成GSH，與Gpx4共同將脂質(zhì)過氧化氫還原為脂醇[17，22-25]。反之該系統(tǒng)失衡會進(jìn)一步促進(jìn)鐵死亡。

許多神經(jīng)疾病的病理生理過程均涉及鐵死亡，包括癲癇等[25-29]。目前，相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)鐵死亡與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。在戊四唑和匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇動物模型的海馬組織中，PTGS2 mRNA表達(dá)升高，脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物MDA和4-羥基壬醛(4-HNE)含量增加，鐵離子蓄積，Gpx4蛋白表達(dá)下降；而鐵死亡抑制劑鐵蛋白-1(Fer-1)可以有效減少鐵、MDA和4-HNE的蓄積，降低PTGS2 mRNA的表達(dá)，提高Gpx4活性，進(jìn)一步緩解癲癇的發(fā)作[9]。在海人酸致大鼠顳葉癲癇模型中，鐵死亡抑制因子Gpx4以及GSH表達(dá)下降，過氧化脂質(zhì)和鐵蓄積；經(jīng)Fer-1處理后，Gpx4和GSH水平升高，過氧化脂質(zhì)和鐵含量減少[30]。本研究構(gòu)建了體外無鎂癲癇細(xì)胞模型，探究鐵死亡與無鎂癲癇細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果顯示，經(jīng)無鎂細(xì)胞外液處理的海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活性顯著降低，脂質(zhì)過氧化抑制因子SLC7a11、Gpx4蛋白表達(dá)和GSH含量顯著降低，鐵離子含量、脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)因子ACSL4蛋白表達(dá)和MDA含量明顯升高，提示癲癇細(xì)胞模型發(fā)生鐵死亡。

VPA是臨床上最常使用的一線廣譜抗癲癇藥物，其抗癲癇機(jī)制復(fù)雜，主要與提高腦內(nèi)GABA含量相關(guān)[31]。研究報(bào)道VPA可通過抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，在脊髓損傷、缺血性腦卒中、偏頭痛等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[32]。LI等[32]研究證實(shí)，VPA可減輕硝酸甘油所致偏頭痛大鼠腦組織損傷，恢復(fù)抗氧化因子水平，降低ROS的水平；研究顯示，VPA單藥治療可顯著降低兒童癲癇患者血清中MDA、H2O2、3-硝基酪氨酸氧化標(biāo)志物水平，具有明顯的抗氧化作用[10]；動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在GBR12909誘導(dǎo)的小鼠躁狂模型中，VPA阻斷了紋狀體和前額葉皮質(zhì)的脂質(zhì)過氧化,逆轉(zhuǎn)了紋狀體的GSH水平[33]。以上研究提示VPA對氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化有抑制作用，而鐵死亡的核心標(biāo)志是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化，提示VPA可通過抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，阻斷鐵死亡，從而保護(hù)癲癇發(fā)作所致的神經(jīng)元死亡，但目前尚沒有研究證實(shí)抑制鐵死亡亦是VPA抗癲癇的藥理機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)VPA干預(yù)后的無鎂致癲癇樣放電海馬神經(jīng)元ACSL4蛋白表達(dá)、鐵離子含量以及MDA明顯降低，同時細(xì)胞存活率、SLC7a11和Gpx4蛋白表達(dá)、GSH含量明顯增高，提示VPA可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化抑制鐵死亡，在癲癇樣放電海馬神經(jīng)元中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但其抑制鐵死亡的具體機(jī)制尚不明確。當(dāng)前研究顯示，VPA可以保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性損傷，谷氨酸蓄積可以導(dǎo)致鐵死亡[5,34]。本研究顯示，VPA干預(yù)可提高海馬神經(jīng)元中SLC7a11蛋白的表達(dá)，提示VPA可以通過system Xc-通路抑制鐵死亡。有研究顯示，VPA可增加血腦屏障中的毛細(xì)血管內(nèi)皮和周皮細(xì)胞中鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是鐵死亡的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，可將細(xì)胞內(nèi)鐵外排，維持鐵穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)控鐵死亡[35]。本研究結(jié)果也顯示，VPA干預(yù)后可降低海馬神經(jīng)元中鐵離子蓄積，提示VPA也可通過鐵代謝通路參與鐵死亡的調(diào)控。

綜上所述，本研究從細(xì)胞層面驗(yàn)證了鐵死亡參與了癲癇的病理過程，VPA可通過抑制癲癇樣放電海馬神經(jīng)元的鐵死亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有助于我們進(jìn)一步解析癲癇的發(fā)病機(jī)制，為臨床上通過靶向鐵死亡來防治癲癇提供理論依據(jù)。同時后續(xù)應(yīng)深入研究鐵死亡參與癲癇發(fā)生的具體分子機(jī)制和作用途徑，以期為靶向抑制鐵死亡治療癲癇提供新的研究方向。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：高靜、陽勇、姚敏怡參與了研究設(shè)計(jì)；高靜、姚敏怡、王明健、劉雪參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byGAOJing,YANGYong, andYAOMinyi. The manuscript was drafted and revised byGAOJing,YAOMinyi,WANGMingjian, andLIUXue. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.