張紅 吳昊2 姜磊2 魯曉晴

(1 青島大學公共衛(wèi)生學院，山東 青島 266071； 2 青島大學華賽醫(yī)學細胞和蛋白質藥物研究院)

自然殺傷(NK)細胞是機體重要的先天性免疫細胞，也是抵御病毒感染或者惡性腫瘤的第一道防線[1]。NK細胞主要分布在外周血中，占外周血單個核細胞(PBMC)的比例為5%～20%，在腫瘤患者體內(nèi)，其抗腫瘤免疫的作用會受到限制[2-3]。因此必須在體外擴增培養(yǎng)大量有活性的NK細胞以滿足患者臨床治療的需要。

研究表明，細胞因子對NK細胞影響各不相同，多細胞因子聯(lián)合應用能更好促進NK細胞增殖和活化[4-9]。然而如何對影響NK細胞增殖活化的因素進行選擇和優(yōu)化，從而達到最佳效果，迄今為止，尚無一致結論。本研究首先從NK細胞的擴增數(shù)量、表型以及功能實驗等方面對NK細胞體外擴增方法進行驗證，以期為NK細胞免疫治療提供理論基礎和實驗依據(jù)；然后再通過磁性細胞分選(MACS)技術獲得不同培養(yǎng)階段純化后的NK細胞，進行轉錄組測序(RNA-seq)分析[10-11]，進一步探討NK細胞體外增殖活化的信號通路，為基于NK細胞藥物的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

人淋巴細胞分離液購于美國Alere公司，IFN-γ ELISA試劑盒購于美國R&D生物科技公司，重組人IL-2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-18、rhIL-21和抗人CD16單克隆抗體均為同立海源生物科技有限公司產(chǎn)品；鼠抗人CD56、CD3流式抗體購于美國BD公司，免疫磁珠、分選器以及分選柱均購于德國Miltenyi公司，腫瘤細胞株K562-GFP購買于美國ATCC細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)

選取健康志愿者6例(健康體檢者，男女不限，年齡18～45歲)，每例志愿者均無菌采集外周血50 mL作為樣本，分離PBMC，每例樣本的PBMC分別使用包被過CD16抗體的T25細胞培養(yǎng)瓶以密度1.5×109個/L進行培養(yǎng)，并且每瓶均加入5 mL人淋巴細胞無血清培養(yǎng)基(含體積分數(shù)0.05的人滅活自體血清，以及體積分數(shù)0.001的rhIL-2、體積分數(shù)0.003的rhIL-12、體積分數(shù)0.002 5的rhIL-15、體積分數(shù)0.005的rhIL-18、體積分數(shù)0.001的rhIL-21)；每2～3 d補充上述培養(yǎng)液一次，并在第0、3、5、7、10和14天時對每例樣本的培養(yǎng)液在倒置顯微鏡下觀察細胞的擴增情況；分別于第0、10、14天收集每例樣本的細胞進行后續(xù)表型和功能實驗的檢測。采用含體積分數(shù)0.10 FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中對腫瘤細胞株K562-GFP進行傳代培養(yǎng)，取生長旺盛的細胞備用。

1.3 流式細胞術檢測NK細胞表型

收集每例樣本培養(yǎng)第0、10、14天的細胞，并將細胞密度調(diào)整為1×109個/L，將上述細胞熒光標記CD3-APC、CD56-PE抗體，用于流式細胞儀檢測。每個時間點的NK細胞均設置同型的IgG陰性對照，在4 ℃條件下避光孵育20 min后，使用PBS漂洗2次，加入100 μL PBS重懸細胞后，用流式細胞儀檢測和分析NK細胞表型，即CD3-CD56+細胞所占比例。

1.4 NK細胞體外殺傷活性檢測

取生長旺盛的K562-GFP靶細胞懸液進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×108個/L，在12孔板上根據(jù)效靶比依次為5∶1、10∶1和 20∶1加入相應細胞密度的NK效應細胞(每例樣本培養(yǎng)第0、10、14天的NK細胞)，同時設置只有K562-GFP靶細胞的對照孔，置于細胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)4 h，收集細胞，采用流式細胞術檢測各組NK細胞的殺傷活性。殺傷活性的計算公式：[(對照組K562-GFP活細胞數(shù)-實驗組K562-GFP活細胞數(shù))/對照組K562-GFP活細胞數(shù)]×100%。

1.5 ELISA方法檢測不同時間點NK細胞IFN-γ的分泌情況

提取每例樣本培養(yǎng)第0、10、14天的NK細胞，以ELISA方法檢測細胞中IFN-γ的分泌情況，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。每個時間點的NK細胞設置3個復孔，結果取均值。

1.6 純化NK細胞并行RNA-seq和基因富集分析

根據(jù)上述對NK細胞進行細胞表型和功能實驗的檢測結果，篩選出最優(yōu)的3例志愿者樣本，篩選標準為NK細胞純度、殺傷活性以及IFN-γ分泌量均較高者。分別收集這3例最優(yōu)志愿者體外培養(yǎng)第0、10、14天的細胞進行MACS，先用CD3磁珠進行陰性分選，再用CD56磁珠進行陽性分選，獲得純化后的NK細胞，即CD3-CD56+細胞，計算NK細胞的純化效率(3例樣本不同時間純化效率的平均值)。對每例樣本每一個時間點純化后的NK細胞分別進行RNA-seq分析，委托北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。對RNA-seq結果，以|log2(Fold Change)|>2且P<0.05為標準篩選出不同時間點NK細胞中差異表達基因(DEGs)，并對DEGs進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 NK細胞的體外擴增情況以及表型分析

從第1天開始，體外擴增的NK細胞形態(tài)發(fā)生改變，變亮變圓，逐漸出現(xiàn)抱團聚集現(xiàn)象。NK細胞在培養(yǎng)前5 d生長較為緩慢，最快增殖時間為培養(yǎng)的第7～14天(圖1)。當細胞培養(yǎng)至第10天時，細胞數(shù)量達到(37.27±4.29)×106個，當細胞培養(yǎng)至第14天時，細胞的數(shù)量達到(48.93±4.43)×106個。使用流式細胞儀分析培養(yǎng)至第0、10、14天時NK細胞(CD3-CD56+)的比例，結果詳見圖2A～C，其中Q1區(qū)為NK細胞所在區(qū)域，第14天時NK細胞(CD3-CD56+)的比例超過90%。

A～C分別為培養(yǎng)第0、10、14天的NK細胞圖1 NK細胞體外擴增情況Fig.1 In vitro amplification of NK cells

A～C分別為流式細胞儀檢測第0、10、14天時NK細胞(CD3-CD56+)所占比例圖2 NK細胞表型檢測Fig.2 NK cell phenotype

2.2 NK細胞對K562細胞的殺傷活性分析

析因設計的方差分析顯示，時間、效靶比、時間和效靶比交互對NK細胞的殺傷活性均有顯著影響(F時間=4 086.28，F(xiàn)效靶比=2 857.25，F(xiàn)時間*效靶比=341.18，P<0.05)；單獨效應分析顯示，在效靶比相同時，第10天和第14天時NK細胞殺傷活性均較第0天明顯增強，在同一時間點，不同效靶比的NK細胞對K562細胞的殺傷活性比較差異具有顯著性(F=124.40～5 512.00，P<0.05)。見表1。

2.3 不同時間點NK細胞IFN-γ的分泌情況比較

檢測結果顯示，第0、10、14天時NK細胞IFN-γ分泌量分別為(1.42±0.13)、(41.22±1.18)和(45.85±1.23)μg/L，不同時間點比較差異有顯著性(F=1 697.00，P<0.05)，其中第14天與第0、10天時比較差異均具有統(tǒng)計學意義(q=67.17、7.75，P<0.05)。

表1 不同效靶比和不同時間點時NK細胞對K562細胞的殺傷活性比較Tab.1 Comparison of killing activity of NK cells against K562 cells at different effector/target ratios and different time points

2.4 不同時間點NK細胞純化效率

檢測結果顯示，這3例最優(yōu)志愿者不同時間點的NK細胞經(jīng)過MACS純化以后，NK細胞(CD3-CD56+)的比例達到(94.69±1.33)%。

2.5 不同時間點NK細胞的RNA-seq分析結果

RNA-seq分析結果顯示，與第0天相比，培養(yǎng)至第10天時NK細胞中上調(diào)DEGs有1 458個，下調(diào)DEGs有1 748個；與第0天相比，培養(yǎng)至第14天時NK細胞中上調(diào)DEGs有1 077個，下調(diào)DEGs有1 103個。與第10天相比，培養(yǎng)至第14天時NK細胞中上調(diào)DEGs有0個，下調(diào)DEGs有4個。GO功能和KEGG通路富集分析結果顯示，這些DEGs主要與炎癥反應、免疫反應、細胞分裂、細胞增殖相關，而且顯著富集在細胞周期、成骨細胞分化、造血細胞調(diào)控、NF-Kappa B等信號通路上。

3 討 論

NK細胞活化是指通過IL等外界因子的刺激作用，使NK細胞比作用前具有更強的殺傷活性，從而使機體在抗病毒感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[12]。由于目前對NK細胞活化相關基因組信息的研究有限，導致對NK細胞生長發(fā)育和功能調(diào)控的許多機制均不明了，限制了其進一步的應用。本研究通過MASC方法獲得純化后不同培養(yǎng)時間的NK細胞并進行RNA-seq分析，篩選出DEGs，為探討NK細胞活化的基因表達通路以及進一步解決臨床應用中所遇到的問題，提供研究方法和手段。

本研究中NK細胞體外擴增情況和表型分析結果顯示，當細胞培養(yǎng)至第14天時，細胞數(shù)量達到(48.93±4.43)×106個，NK細胞(CD3-CD56+)的比例超過90%，這表明該培養(yǎng)方法不僅可以有效誘導PBMC成為NK細胞，使其大量增殖并且保證了擴增純度。NK細胞殺傷活性和IFN-γ分泌量檢測結果顯示，第10、14天NK細胞殺傷活性較第0天明顯增強，在同一時間點，隨著效靶比提高，殺傷活性均逐步增強；培養(yǎng)至第14天的NK細胞IFN-γ分泌量均高于第10、0天。這表明該培養(yǎng)方法可以提高NK細胞的殺傷活性和細胞毒作用。本研究建立的NK細胞體外擴增培養(yǎng)方法，無需飼養(yǎng)層細胞，也無需基因改造，就可直接從PBMC中獲得高質量、高殺傷活性和高擴增倍數(shù)的NK細胞，從而提高了NK細胞臨床應用的安全性[13-16]。本研究RNA-seq結果顯示，第10、14天NK細胞與第0天NK細胞比較，DEGs均增多，且第10天DEGs多于第14天，表明在現(xiàn)有培養(yǎng)方案下，體外培養(yǎng)至第10天的NK細胞處于增殖活化的關鍵時期，到第14天時NK細胞已經(jīng)處于平臺期。第10天和第14天NK細胞相比只有4個DEGs，表明這兩組的組間差異較小，樣本間表達模式的相似度較高。GO功能和KEGG通路富集分析結果均顯示，這些DEGs與炎癥反應相關，這表明炎癥反應可能在NK細胞活化發(fā)揮作用方面扮演著重要角色。

本研究的創(chuàng)新之處在于首先通過建立NK細胞體外擴增培養(yǎng)方法，比較分析健康人NK細胞在不同時間點的擴增情況、殺傷活性和細胞毒性，探討該培養(yǎng)方法對于NK細胞體外增殖活化不同時期的影響，對未來臨床NK細胞藥物的開發(fā)提供參考。此外通過對不同時間點純化后NK細胞進行RNA-seq分析，了解不同培養(yǎng)階段NK細胞的基因表達情況，為后續(xù)深入研究NK細胞的特性、探討體外增殖活化潛在的分子調(diào)控機制提供了研究方法和研究手段。

目前NK細胞活化的途徑有兩種假說，即“喪失自我”和“壓力誘導”[17-19]?；罨腘K細胞通過不同的機制發(fā)揮功能，許多研究表明炎癥反應與NK細胞的活化密切相關[20-22]。本研究的GO功能和KEGG通路富集分析結果也顯示這些DEGs與炎癥反應相關，因此本文重點探討和炎癥反應有關的NF-Kappa B信號通路。事實上，通過與炎癥反應相關的細胞因子使NK細胞活化，從而對腫瘤細胞進行殺傷的治療手段已經(jīng)應用于臨床[23-24]。研究表明NF-Kappa B信號通路的特異性阻斷劑MG132可以部分下調(diào)NK細胞的細胞毒活性，并同時抑制NK細胞的增殖，這可能是通過調(diào)節(jié)IFN-γ、FASL、perforin等殺傷分子的表達從而發(fā)揮其調(diào)控NK細胞活化的作用[25]。然而，關于調(diào)控NK細胞活化的具體細節(jié)并不清楚，還需要進一步的探索和研究。

本研究也存在一些局限性，如樣本量較小，無法更好地設置生物學重復，并且只是在生物信息學分析下的理論研究，下一步還應進行一些分子生物學實驗的驗證，從而進一步闡明NK細胞體外活化的具體機制和作用。

綜上所述，本研究從方法學的角度探索CD16抗體聯(lián)合5種細胞因子體外擴增培養(yǎng)NK細胞方法的有效性，并在NK細胞擴增數(shù)量、表型檢測和功能實驗方面進行驗證，為NK細胞免疫治療提供理論基礎和實驗依據(jù)，從而為進一步解決臨床應用所遇到的問題提供研究方法和手段。另外，本研究還通過對不同時間點純化后的NK細胞進行RNA-seq分析，尋找與維持NK細胞增殖活化相關的信號通路,為基于NK細胞藥物的開發(fā)提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有實驗均已通過青島大學醫(yī)學部倫理委員會的審核批準(文件號QDU-HEC-2022163)。所有實驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Ethics Committee of Qingdao University Faulty of Medicine (Approval Letter No. QDU-HEC-2022163, and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of Declaration Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：張紅、魯曉晴、姜磊、吳昊參與了研究設計；魯曉晴、張紅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byZHANGHong,LUXiaoqing,JIANGLei,andWUHao. The manuscript was drafted and revised byLUXiaoqingandZHANGHong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.