曹 錕， 王若男， 熊興東， 吳 赟*， 劉新光*

(1. 廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室/衰老研究所/生物化學與分子生物學研究所， 東莞 523808； 2. 廣東醫(yī)科大學科研平臺服務管理中心， 東莞 523808)

β-半乳糖苷酶是一類能夠水解半乳糖苷鍵的糖苷酶，通常由4個亞基組成四聚體，一般可催化乳糖分解為一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖[1-3]。該酶廣泛存在于動植物、微生物體內(nèi)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同來源的β-半乳糖苷酶具有較高的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性，表明該酶的保守性較高[4-5]。近年來，該酶在蛋白質(zhì)工程、酶工程和食品工業(yè)方面的用途越來越廣泛。β-半乳糖苷酶在食品加工方面的應用主要包括以下3個方面：(1)食品級的β-半乳糖苷酶已被廣泛生產(chǎn)應用，這有利于解決世界上約70%～90%的成年人體內(nèi)由于缺乏該酶而導致的乳糖不耐受問題；(2)該酶能導致乳糖的水解并顯著提高乳制品的甜度，將該酶應用在食品生產(chǎn)加工方面能夠減少甜味劑的用量，降低生產(chǎn)成本；(3)該酶能降解細胞壁多糖并釋放出游離的半乳糖，進而加快植物乙烯的生成，最終促進果蔬軟化和成熟[6-8]。

鑒于β-半乳糖苷酶作為食品添加劑具有上述幾個重要作用，因此，探索該酶的生物活性與溫度的關(guān)系具有一定的意義，進一步確定該酶的最適酶解溫度及熱變性條件能夠為食品加工領(lǐng)域提供理論基礎[9-10]。然而，考慮到工業(yè)應用價值及其安全性，目前只有微生物體內(nèi)的β-半乳糖苷酶是被廣泛應用于商業(yè)酶源，如乳克魯維酵母和脆壁克魯維酵母[11-12]。因此，本研究以乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶為研究對象，針對其1 025個氨基酸殘基進行了分子動力學模擬，該模擬體系的難點在于原子總數(shù)多、計算量大，本研究將采用顯式溶劑模型計算β-半乳糖苷酶的構(gòu)象變化、熱變性溫度以及不同溫度條件下影響β-D-半乳吡喃糖GAL配體小分子的結(jié)合微環(huán)境，最終揭示乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶的溫度耐受性機制。

1 材料與方法

1.1 分子模擬的條件

本研究中乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)(code:3ob8)來自于Protein Data Bank(PDB)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.rcsb.org/)。通過Gromacs 2020.4軟件構(gòu)建了4個獨立的模擬體系，即溫度條件分別被設置為35、50、65、80 ℃，對應的開爾文單位為308.15、323.15、338.15、353.15 K，接下來對該酶1 025個氨基酸殘基分別進行總時長為 50 ns的分子動力學模擬。選擇這4個溫度的依據(jù)分別是：35 ℃為生物體的最適生長溫度，可代表正常狀態(tài)下的β-半乳糖苷酶；50～65 ℃是經(jīng)過預實驗測試的大致變性起始溫度，也是大多數(shù)蛋白比較常見的開始發(fā)生變性的溫度區(qū)間[13-15]；80 ℃是能使自然界大多數(shù)蛋白趨于完全變性狀態(tài)的溫度[16-17]，本研究以此溫度作為該酶在乳克魯維酵母體內(nèi)可能的完全變性條件。采用Gromos43a1分子力場、SPC水模型，并將該酶的晶體構(gòu)象放置于立方周期盒子中作為起始構(gòu)象，設定其與盒子的邊界最小距離為1.0 nm，模擬系統(tǒng)的周期性邊界條件適用于X、Y、Z3個方向。為了中和蛋白體系的電荷，在體系中加入0.15 mol/L NaCl鹽溶液。采用蛙跳算法計算每個原子的運動，以粒子網(wǎng)格算法(Particle Mesh Ewald)計算靜電相互作用能量[18]。接下來，通過最速下降法進行400步能量最小化，并對每個模擬體系進行總時長為50 ps的位置約束模擬。正式動力學模擬的初速度被設定為隨機初始速度。

1.2 模擬結(jié)果的分析

首先，采用Gromacs 2020.4軟件的gmx rms、gmx gyrate、gmx rmsf和gmx sasa工具分別計算了蛋白的均方根誤差(Root Mean Square Deviation,RMSD)、回旋半徑(Radius of gyration，Rg)、溶劑可及表面積(Solvent Accessible Surface Area,SASA)以及每個氨基酸殘基的α-C的均方根波動值(Root Mean Square Fluctuation,RMSF)，并通過VMD-1.9.1可視化軟件觀測4個不同模擬軌跡中蛋白構(gòu)象的變化。然后，參考文獻[18-21],用gmx distance工具測量了β-半乳糖苷酶的底物——GAL糖分子結(jié)合位點殘基之間的距離，并分別采用Origin8.5 和 PyMOL 軟件繪制圖形及結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)概況

乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)是由4個相同亞基組成的同源四聚體，每個亞基由1 025個氨基酸殘基組成，其相對分子質(zhì)量約為118 500。三維構(gòu)象的主要特點是多數(shù)β-折疊區(qū)域暴露在蛋白表面，而α-螺旋則位于蛋白中心區(qū)域(圖1A)，這一特征與大多數(shù)蛋白的結(jié)構(gòu)特點呈相反狀態(tài)。GAL糖分子、Mg2+和Mn2+離子的主要結(jié)合位點位于α-螺旋之中，β-折疊則對蛋白骨架的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。在模擬體系中添加了水分子和NaCl鹽離子，能量優(yōu)化后的立方體盒子參數(shù)x、y、z均為13.992 78 nm(圖1B)，展示了該蛋白的立方體模擬體系。

圖1 β-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)及其模擬體系構(gòu)型展示

2.2 蛋白整體構(gòu)象變化的原子表述

為了監(jiān)測蛋白平衡狀態(tài)的構(gòu)象與原始結(jié)構(gòu)之間的平均偏差，采用RMSD來評價體系是否達到平衡狀態(tài)。由圖2A可知：35 ℃時，β-半乳糖苷酶最先達到平衡狀態(tài)，對應的RMSD也是最低的，約為0.35 nm;50 ℃時，β-半乳糖苷酶的RMSD升高較為明顯，并且該酶未達到平衡狀態(tài)，結(jié)合文獻[22]的結(jié)果：β-半乳糖苷酶的熔解溫度大約為51 ℃，因此，判斷50 ℃大致可以代表該酶的熔解溫度臨界值，而該酶在50 ℃條件下的模擬結(jié)果則能夠代表其在熔解溫度時的各項指標；65 ℃和80 ℃時，β-半乳糖苷酶的RMSD的最大值大于0.51 nm，在50 ns內(nèi)無法達到平衡狀態(tài)，說明這2個溫度條件下的蛋白結(jié)構(gòu)非常不穩(wěn)定，已經(jīng)發(fā)生了變性，故將65 ℃和80 ℃定義為變性條件。SURVE和MAHONEY[22]已證實β-半乳糖苷酶的熔解溫度大約為51 ℃，因此，本研究設置的模擬條件中的50 ℃能夠代表該酶的熔解溫度。

RMSF的變化能夠評價蛋白質(zhì)碳骨架的每個原子相對于其平均位置的漲落，由此可以判斷不同溫度時蛋白的變性程度。由圖2B可知：35 ℃時，β-半乳糖苷酶對應的RMSF最低，此時的蛋白具備正常的酶活力，則將35 ℃的結(jié)果視為正常值；80 ℃時，β-半乳糖苷酶有大量氨基酸殘基的RMSF遠高于正常值且呈現(xiàn)劇烈的波動，說明蛋白質(zhì)碳骨架在變性狀態(tài)下的不穩(wěn)定性增加。這些結(jié)果說明高溫將導致該酶的空間結(jié)構(gòu)被破壞。

蛋白質(zhì)碳骨架的回旋半徑隨模擬時長的變化能夠代表結(jié)構(gòu)的松散程度。由圖2C可知：經(jīng)過50 ns的模擬，35 ℃時β-半乳糖苷酶對應的α-C的Rg平均值約為 3.20 nm；在50 ℃、65 ℃時，該酶對應的α-C的Rg平均值分別為 3.24、3.23 nm，這表明當處于熔解溫度臨界值(50 ℃)時，該酶的結(jié)構(gòu)開始改變；80 ℃時，該酶的氨基酸殘基呈現(xiàn)出剛性，大量的成鍵已被破壞，對應的α-C的Rg平均值為3.32 nm。這些結(jié)果表明，乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶從50 ℃開始呈現(xiàn)不同程度的變性，當溫度升高至80 ℃時，蛋白構(gòu)象已經(jīng)趨于完全變性的狀態(tài)。

圖2 模擬過程中β-半乳糖苷酶整體的波動性展示

2.3 蛋白構(gòu)象的溶劑可及表面積

由蛋白整體的SASA隨著時間變化情況(圖3A)可知：經(jīng)過50 ns的模擬，35 ℃時的SASA平均值為383.58 nm2，達到β-半乳糖苷酶的熔解溫度(50 ℃)時則升高到 388.52 nm2，更進一步證實了50 ℃為變性起始溫度。而在變性條件(65 ℃、80 ℃)下對應的SASA平均值分別為386.1、386.57 nm2。這些數(shù)據(jù)的變化趨勢與RMSD、Rg的變化趨勢保持一致，表明當大于50 ℃后，蛋白將發(fā)生不可逆的變性。將GAL結(jié)合位點殘基Asn-88、Asp-187、His-389、Glu-414、His-416、Asn-481、Glu-482、Glu-551、His-554和Asp-623歸為一個組，并統(tǒng)計了該組對應的SASA平均值。與35 ℃時的SASA平均值(17.82 nm2)相比，80 ℃時的GAL的結(jié)合位點的SASA平均值高達19.34 nm2(圖3B)。這些結(jié)果表明，高溫促使GAL的結(jié)合位點殘基被暴露在蛋白表面，這與正常狀態(tài)下的GAL活性中心被包埋在蛋白骨架之中相矛盾，故可判斷高溫導致的變性殘基不利于GAL的結(jié)合。

圖3 溫度對β-半乳糖苷酶溶劑可及表面積的影響

2.4 35 ℃和80 ℃條件下β-半乳糖苷酶二級結(jié)構(gòu)變化以及GAL的結(jié)合能力

為了鑒定β-半乳糖苷酶在正常條件與變性條件下的二級結(jié)構(gòu)變化，采用do_dssp插件解析了蛋白二級結(jié)構(gòu)各組分的含量[23]。與35 ℃時的結(jié)果相比，80 ℃時β-半乳糖苷酶的二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大的改變(圖4A、B)：35 ℃時平均有358個氨基酸殘基形成β-轉(zhuǎn)角，269個氨基酸殘基參與形成無規(guī)卷曲；然而在80 ℃時，平均有333個氨基酸殘基形成β-轉(zhuǎn)角，287個氨基酸殘基參與形成無規(guī)卷曲。這些數(shù)據(jù)說明，高溫會導致β-半乳糖苷酶中一部分氨基酸殘基由β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲，從而改變二級結(jié)構(gòu)各組分的含量占比并破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，最終使酶喪失生物活性。

因此，上述分子模擬的數(shù)據(jù)進一步證實溫度過高會導致β-半乳糖苷酶變性。接下來，研究了GAL糖分子的結(jié)合位點殘基Asn-88、Asp-187、His-389、Glu-414、His-416、Asn-481、Glu-482、Glu-551、His-554和Asp-623的空間成鍵并測量了殘基之間的空間距離。結(jié)果(圖4C、D)表明：35 ℃時的β-半乳糖苷酶內(nèi)部依靠約13個氫鍵緊密結(jié)合GAL糖分子，而與之形成鮮明對比的是，80 ℃時的結(jié)合位點殘基對之間的空間距離變大，這種現(xiàn)象是由于結(jié)合位點殘基被暴露在蛋白表面而造成的，表現(xiàn)在Asn-88與Glu-551、Asp-623與Glu-482、His-554與His-416的距離分別為1.40、1.77、1.62 nm，空間距離越大越不利于GAL的結(jié)合，即β-半乳糖苷酶失去了催化β-D-半乳吡喃糖的功能。

3 小結(jié)

本研究采用分子動力學模擬的計算方法研究β-半乳糖苷酶的溫度耐受性，分析并揭示了不同溫度條件對該酶穩(wěn)定性及酶活性產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明：β-半乳糖苷酶在35 ℃時的蛋白結(jié)構(gòu)及氨基酸波動性比較穩(wěn)定；當溫度升高至50 ℃，β-半乳糖苷酶的Rg和SASA均增大，說明蛋白結(jié)構(gòu)逐漸失去柔性，該蛋白二級結(jié)構(gòu)各組分的含量占比也會隨之改變。這與SURVE等[11]報道的β-半乳糖苷酶的熔解溫度約為51 ℃的結(jié)論相一致。更重要的是，本研究首次報道了當溫度高于熔解溫度的臨界值(50 ℃)時，GAL糖分子的活性中心殘基將會暴露在蛋白表面，這將導致β-半乳糖苷酶喪失催化GAL的能力，進一步造成該酶無法降解細胞壁多糖、無法解決人體的乳糖不耐受等關(guān)鍵問題。因此，在乳制品發(fā)酵、催熟果蔬軟化及增加甜度、飼料加工等方面，必須嚴格控制溫度低于50 ℃，以確保β-半乳糖苷酶的活性?？傊?，本研究在原子水平上探索了β-半乳糖苷酶的熔解溫度臨界值，揭示了β-半乳糖苷酶活性及溫度耐受性等關(guān)鍵信息，為相關(guān)的食品生產(chǎn)加工以及發(fā)酵提供理論支持，具有一定的工業(yè)應用價值。

圖4 溫度對β-半乳糖苷酶二級結(jié)構(gòu)及其與GAL分子結(jié)合能力的影響