(青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，山東 青島 266003)

肝癌是世界上最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤之一。根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，肝癌是癌癥死亡的第4大原因[1-3]。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，與慢性肝病關(guān)系密切，HBV感染、HCV感染、酗酒和非酒精性脂肪肝等疾病是主要誘因[4]。

糖類(lèi)是為機(jī)體提供生命活動(dòng)所需能量的主要物質(zhì)，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的主要能量也來(lái)源于糖的代謝,葡萄糖在體內(nèi)發(fā)生氧化分解的兩條主要途徑是氧化磷酸化和糖酵解。研究顯示糖酵解能影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[5]。細(xì)胞通過(guò)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，生成丙酮酸，這一過(guò)程稱(chēng)為糖酵解。丙酮酸在缺氧條件下轉(zhuǎn)化成乳酸，而在有氧條件下經(jīng)線粒體氧化磷酸化代謝后產(chǎn)生能量。腫瘤細(xì)胞活性狀態(tài)與其所獲得的能量緊密相關(guān)[6]。腫瘤細(xì)胞的能量供給與正常細(xì)胞不同，即使在氧含量充足的情況下也會(huì)優(yōu)先通過(guò)糖酵解途徑消耗更多的葡萄糖產(chǎn)生能量，滿足自身的需要，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“Warburg effect”或“有氧糖酵解”[7-8]。

本研究首先通過(guò)癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出HCC組織與正常組織中差異表達(dá)的基因，構(gòu)建HCC中糖酵解相關(guān)基因的預(yù)后模型；探討糖酵解相關(guān)基因與HCC患者生存率的關(guān)系；通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)cBioPortal分析預(yù)后模型中基因的突變位點(diǎn)；并通過(guò)單因素和多因素分析探討影響HCC預(yù)后的獨(dú)立因素。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與處理

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)[9](包含有50例正常組織樣本和374例腫瘤組織樣本及377例患者的臨床特征數(shù)據(jù))檢索并下載HCC的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床特征信息，利用軟件Strawberry Perl 5.32.0[10]將基因表達(dá)數(shù)據(jù)整理成為表達(dá)矩陣用于后續(xù)分析。

1.2 基因富集分析

從GSEA(www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)網(wǎng)站的MSigDB(Molecular Signatures Database)數(shù)據(jù)庫(kù)[11]中獲得REACTOME_GLYCOLYSIS.gmt基因集作為參照基因集，利用基因富集分析(4.1.0版本)軟件分析正常組織與腫瘤組織的基因與糖酵解途徑的富集程度，按照基因富集分析軟件默認(rèn)參數(shù)，隨機(jī)組合1 000次進(jìn)行富集分析。按矯正后的P值(FDR)進(jìn)行排序，并將FDR<0.05的基因集作為顯著富集基因集，也就是糖酵解相關(guān)基因集。

1.3 構(gòu)建糖酵解相關(guān)基因的預(yù)后模型并進(jìn)行生存分析

使用軟件Strawberry Perl 5.32.0提取糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)量，構(gòu)建表達(dá)矩陣，進(jìn)行正常組織和腫瘤組織的差異分析，獲得差異表達(dá)的糖酵解相關(guān)基因；對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，構(gòu)建預(yù)后模型，獲得與HCC患者預(yù)后密切相關(guān)的糖酵解相關(guān)基因，為預(yù)后相關(guān)糖酵解基因。使用R4.0.2軟件對(duì)預(yù)后相關(guān)糖酵解基因及377例HCC患者的臨床特征進(jìn)行生存分析，并依據(jù)基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組、低風(fēng)險(xiǎn)組，繪制ROC曲線，獲取曲線下面積(AUC)。

1.4 糖酵解相關(guān)基因預(yù)后分析

使用R4.0.2繪制預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的表達(dá)熱圖以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者生存時(shí)間的模式圖，并進(jìn)行單因素和多因素的獨(dú)立預(yù)后分析。使用R語(yǔ)言在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)預(yù)后相關(guān)糖酵解基因進(jìn)行差異表達(dá)分析；繪制預(yù)后相關(guān)糖酵解基因與腫瘤臨床分級(jí)的生存曲線。根據(jù)患者年齡及腫瘤分級(jí)、分期進(jìn)行分層分析，將患者分為不同類(lèi)別的亞組，繪制預(yù)后相關(guān)糖酵解基因與不同亞組的生存曲線。使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)cBioPortal(www.cbioportal.org)[12]分析預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的突變類(lèi)型以及突變率。

1.5 組織標(biāo)本的獲取以及預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的檢測(cè)

收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科行肝癌部分肝切除術(shù)的30例HCC患者的腫瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本，使用RNAiso plus試劑盒(日本TaKaRa公司)提取兩種組織標(biāo)本中的總RNA以后，采用PrimeScript TM RT Reagent Kit(日本TaKaRa公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)。后在LightCycler 480上使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的相對(duì)表達(dá)量，使用軟件graphpad 8.0 進(jìn)行組間比較的t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常樣本和腫瘤樣本的基因富集分析

將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的424例樣本的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的糖酵解相關(guān)基因集作為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基因富集分析顯示，正常組織與腫瘤組織的基因均與糖酵解途徑密切相關(guān)。

2.2 篩選HCC中糖酵解相關(guān)基因并構(gòu)建預(yù)后模型

使用軟件Strawberry Perl 5.32.0分析篩選出正常組織和腫瘤組織中差異表達(dá)糖酵解相關(guān)基因42個(gè)，進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析，構(gòu)建預(yù)后模型，顯示B3GAT3、NDC1、KIF20A3個(gè)基因與HCC預(yù)后密切相關(guān)，為預(yù)后相關(guān)糖酵解基因。

2.3 糖酵解相關(guān)基因驗(yàn)證與HCC預(yù)后分析

通過(guò)R4.0.2軟件結(jié)合患者的臨床特征對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組患者進(jìn)行生存分析顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的總體生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于高風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.001)，繪制的ROC曲線的AUC值為0.691。對(duì)預(yù)后相關(guān)糖酵解基因繪制表達(dá)熱圖顯示，B3GAT3、NDC1、KIF20A隨著基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分增大，基因表達(dá)隨之增高；同時(shí)隨著基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分升高，患者的生存時(shí)間顯著縮短。單因素以及多因素的獨(dú)立預(yù)后分析顯示，患者的腫瘤分期(HR=1.68，95%CI=1.37～2.06,P<0.05)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(HR=1.10，95%CI=1.06～1.13,P<0.05)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)圖1A、B。

A：預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的單因素獨(dú)立預(yù)后分析，B：預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的多因素獨(dú)立預(yù)后分析

圖1 預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的獨(dú)立預(yù)后分析

Fig.1Independentprognosticanalysisofprognosis-relatedglycolyticgenes

2.4 患者的臨床特征和預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的分層分析

使用R語(yǔ)言比較B3GAT3、NDC1、KIF20A在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異情況，結(jié)果示3個(gè)基因在腫瘤組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。通過(guò)生存曲線對(duì)B3GAT3、NDC1、KIF20A與臨床特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)B3GAT3、NDC1、KIF20A的HCC患者腫瘤分期較差(圖2A)。根據(jù)患者的年齡、分級(jí)、分期進(jìn)行分層分析，將患者分為不同類(lèi)別的亞組，即年齡>60歲亞組和年齡≤60歲亞組，G1和G2級(jí)亞組、G3和G4級(jí)亞組、T1和T2亞組、T3和T4亞組，Ⅰ期和Ⅱ期亞組，Ⅲ期和Ⅳ期亞組，繪制糖酵解相關(guān)基因與不同亞組的生存曲線顯示，在不同類(lèi)別的亞組當(dāng)中，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存期明顯長(zhǎng)于高風(fēng)險(xiǎn)組患者(圖2B～I(xiàn))。

2.5 B3GAT3、NDC1及KIF20A突變的相關(guān)性研究

基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)3個(gè)基因在HCC組織中的突變情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，3個(gè)基因均可發(fā)生突變，其中B3GAT3發(fā)生擴(kuò)增、深度缺失和錯(cuò)義突變的突變率為1.1%，NDC1發(fā)生擴(kuò)增和錯(cuò)義突變的突變率為0.6%，KIF20A發(fā)生擴(kuò)增和錯(cuò)義突變的突變率為0.8%。

2.6 組織標(biāo)本中基因的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)我院30例HCC患者的腫瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比較，HCC組織中B3GAT3、NDC1、KIF20A均顯著高表達(dá)(t=2.156～2.696)。詳見(jiàn)表1。與對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中信息進(jìn)行分析所獲得的結(jié)果一致。

表1 組織標(biāo)本中預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的差異表達(dá)Tab.1 Differential expression of prognosis-related glycolytic genes in tissue specimens

3 討 論

HCC是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，占全球惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，其死亡率居第4位。雖然手術(shù)切除、放射治療、化療和肝移植等治療方法日益完善[13-14]。但是，由于HCC不易早期發(fā)現(xiàn)、術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高，患者預(yù)后均較差[15]。因此發(fā)現(xiàn)HCC潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物至關(guān)重要[16]。

正常情況下，糖酵解是機(jī)體缺氧時(shí)獲得能量供應(yīng)的主要途徑。在腫瘤細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)與正常細(xì)胞不同的代謝變化。有研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的糖酵解增加，是腫瘤細(xì)胞惡變最基本的變化之一[17-18]。惡性腫瘤的代謝以Warburg效應(yīng)為特征，即腫瘤細(xì)胞的代謝由線粒體的氧化磷酸化向糖酵解轉(zhuǎn)變[19]。雖然有氧糖酵解產(chǎn)生ATP的效率不如氧化磷酸化，但有氧糖酵解可增加還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的合成和氧化防御，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及生存密切相關(guān)[20-21]。腫瘤和糖酵解的相關(guān)性已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，但目前對(duì)糖酵解相關(guān)腫瘤生物標(biāo)志物的研究較少[22]。因此該領(lǐng)域成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，而且糖酵解相關(guān)生物標(biāo)志物也不斷被發(fā)現(xiàn)并研究[23]。

A：預(yù)后相關(guān)糖酵解基因與腫瘤分期的生存分析，B：預(yù)后相關(guān)糖酵解基因在年齡>60歲亞組的生存分析，C：預(yù)后相關(guān)糖酵解基因在年齡≤60歲亞組的生存分析，D～I(xiàn)：預(yù)后相關(guān)糖酵解基因在G1和G2級(jí)亞組、G3和G4級(jí)亞組、T1和T2亞組、T3和T4亞組、Ⅰ期和Ⅱ期亞組、Ⅲ期和Ⅳ期亞組的生存分析圖2 臨床特征和預(yù)后相關(guān)糖酵解基因的預(yù)后分層分析Fig.2 Prognostic stratification analysis of glycolytic genes associated with clinical features and prognosis

以往研究表明，糖酵解相關(guān)基因UCP2能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖，影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，可作為胰腺癌診斷的潛在生物標(biāo)志物[24],但在HCC中糖酵解相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的研究尚不充足。為了研究HCC中預(yù)后相關(guān)糖酵解基因，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析的方法，首先篩選出糖酵解相關(guān)基因，構(gòu)建了預(yù)后模型，獲得預(yù)后相關(guān)的糖酵解基因(B3GAT3、NDC1、KIF20A)，對(duì)預(yù)后相關(guān)糖酵解基因進(jìn)行基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及生存分析發(fā)現(xiàn)，隨著基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增大，患者的生存時(shí)間縮短，生存率降低，因此提示B3GAT3、NDC1、KIF20A可能是與HCC患者預(yù)后密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

B3GAT3是葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因家族的一員，該基因產(chǎn)物通過(guò)葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移反應(yīng)催化糖胺聚糖-蛋白質(zhì)連接的形成[25]。有研究檢測(cè)透明細(xì)胞癌組織中B3GAT3的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比B3GAT3在透明細(xì)胞癌中呈現(xiàn)出顯著高表達(dá)，生存分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)B3GAT3患者的平均生存期明顯低于低表達(dá)患者，B3GAT3被認(rèn)為是透明細(xì)胞癌的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)[26]。NDC1是跨膜核孔蛋白的編碼基因。其可在細(xì)胞周期、有絲分裂和成熟mRNA的運(yùn)輸中發(fā)揮作用[27]。以往研究顯示，NDC1在腫瘤組織的表達(dá)顯著上調(diào)，如食管鱗癌組織、肺癌組織等，并且高表達(dá)的NDC1與食管鱗癌、肺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[28-29]。KIF20A可與三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合形式的RAB6A和RAB6B發(fā)生相互作用?？勺鳛镽AB6調(diào)節(jié)高爾基膜和相關(guān)囊泡沿微管運(yùn)輸所需的馬達(dá)。其可在包括細(xì)胞周期、有絲分裂和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能中發(fā)揮作用[30]。既往研究顯示KIF20A的表達(dá)在膀胱癌中顯著升高，KIF20A高表達(dá)患者的平均生存期明顯短于低表達(dá)患者[31]。下調(diào)KIF20A能有效抑制HCC細(xì)胞的增殖，增加其G1期阻滯作用，因此KIF20A可能作為HCC患者生存的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[32-33]。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法獲得了HCC中與預(yù)后密切相關(guān)糖酵解基因，進(jìn)一步分析顯示B3GAT3、NDC1、KIF20A高表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，也許是HCC患者潛在的生物標(biāo)志物。本研究為HCC預(yù)后生物標(biāo)志物的研究提供了新線索和新思路，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論參考依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL26976)。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL26976), and all experimental protocols were carried out by following The Ethical Guidelines for Human Medical Research. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：曹景玉、朱呈瞻、李坤、劉奎參與了研究設(shè)計(jì)；解宇威、劉鵬、徐翔宇、高瑞謙、高雨菲參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byCAOjingyu,ZHUChengzhan,LIKun, andLIUKui. The manuscript was drafted and revised byXIEYuwei,LIUPeng,XUXiangyu,GAORuiqian, andGAOYufei. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.