楊靜慧，邱雪，張海紅*，郝慧慧

1(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)2(廣州基迪奧生物科技有限公司，寧夏 銀川，750021)

靈武長棗(Lingwu long jujube)又名牙馬棗，因其具有個大色艷、酥脆爽口、酸甜適中、營養(yǎng)豐富的特點而榮獲了寧夏“地理標志保護產(chǎn)品”殊榮。硬度等質地指標是衡量鮮食靈武長棗品質的重要指標。然而，隨著貯藏時間的延長，鮮食長棗硬度下降、質地劣變、水分流失，逐漸喪失了其商業(yè)價值[1]。果品質地軟化、硬度下降與其內部水分遷移、細胞壁降解及細胞壁降解酶的協(xié)同作用息息相關。陳國梁等[2]對木棗的研究發(fā)現(xiàn)，果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、纖維素酶(cellulase，CE)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)、多聚半乳糖酸酸酶(polygalacturonase，PG)等對果實的成熟軟化均起到一定作用。劉鑫[3]對棗皮細胞壁的變化研究表明，果實在貯藏過程中，水分處于充足而穩(wěn)定的狀態(tài)，可以抑制果皮細胞代謝酶的活性，延緩果皮物質的分解代謝，從而減少棗果實軟化的發(fā)生。REN等[4]對番荔枝的研究發(fā)現(xiàn)，果實軟化伴隨著果皮硬度和水分的急劇下降，細胞壁多糖尤其是果膠多糖的降解破壞了細胞壁的網(wǎng)絡結構，引起了水分自高自由度向低自由度遷移，導致采后番荔枝果實軟化。LIU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，杏果在采后貯藏期間硬度下降，果膠多糖逐漸降解， 水溶性果膠(water solute pectin，WSP)、螯合性果膠(chelate solute pectin，CSP)和半纖維素(hemicellulose，HC)的鏈長和鏈寬值均逐漸減小。WANG等[6]利用原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)，從微觀角度對黃花和沾花2個棗樹品種在生熟期和成熟期2個時期進行的研究發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度的增加，其CSP鏈中的長鏈寬鏈都有所減少。

本文擬以靈武長棗為研究對象，研究長棗果實在貯藏期間細胞壁多糖納米結構的降解規(guī)律，探究硬度變化與細胞壁多糖及其降解酶活性、水分的內在聯(lián)系，解析長棗貯藏過程中細胞壁多糖納米結構降解對其硬度變化的響應機理，為其采后貯藏保鮮技術的開發(fā)、品質調控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈武長棗采自寧夏靈武市大泉林場棗園。選取同株體上大小相似，外形完好，且無病蟲害，無機械損傷，八成熟、帶柄的靈武長棗。長棗被采摘后，以聚苯乙烯泡沫箱緩沖包裝后，在0～4 ℃環(huán)境下運回實驗室，并在4 ℃冰箱中貯藏備用。

無水乙醇、咔唑，天津市瑞金特化學試劑有限公司；二甲基亞砜、1,2-環(huán)己二胺四乙酸，天津市津科精細化工研究所；氯仿，中國宿州化學試劑有限公司；碳酸鈉，天津市永大化學試劑有限公司；硼氫化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；蒽酮，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；溴百里酚藍，上海麥克林生化科技有限公司；聚半乳糖醛酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TAXT PLUS/50 物性測定儀，英國Stable Micro system Ltd 公司；NMI20-040V-I低場核磁共振儀，上海紐邁電子科技有限公司；GL-20C高速冷凍離心機，北京哈納科儀科技有限公司；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

依據(jù)長棗保鮮期，設計實驗周期為16 d。從第0天開始，每4 d從預處理樣品中隨機抽取1組，進行測試。實驗設3次重復。

1.3.1 硬度測試

選用P/2n針狀探頭(直徑2 mm)，設定測前速度5 mm/s，貫入速度1 mm/s, 測后速度5 mm/s，最小感知力5 g，穿刺深度5 mm，在整棗赤道部位均勻取3點，用TAXT PLUS/50物性測定儀對整果進行硬度測試[7]。

1.3.2 水分遷移測試

用取樣器取出被測長棗后，去皮，切取約10 mm×10 mm×20 mm大小的組織塊放入核磁檢測管(70 mm)，置于低場核磁共振儀(low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR)的永久磁場中心位置的射頻線圈的中心，利用多脈沖回波序列(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)測量樣品的橫向弛豫時間T2[8]。參數(shù)設置：90 ℃ 脈沖時間為16 μs，180 ℃脈沖時間為34 μs，測定溫度為32 ℃，質子共振頻率為24 MHz，采樣間隔為3 000 ms，回波時間為1 ms，累加次數(shù)為4次，回波個數(shù)為1 000。每個樣品重復3次，將T2進行反演，得到反演圖。

1.3.3 細胞壁多糖的制備和提取

參照BRAHEM等[9]，曹建康等[10]的提取方法，并略加修改。果膠含量用咔唑法測定，纖維素、半纖維素含量用蒽酮法測定[10-11]。

1.3.4 CSP納米結構測量

分別將0、16 d的CSP提取液，稀釋到合適的濃度，取15 μL提取液至潔凈云母片上，室溫下干燥待用。利用AFM(Nano ScopeⅢa型)以非接觸模式進行測試，用Nanoscope軟件分析果膠分子的聚集體、分支結構、鏈寬等屬性。以界面分析法分析果膠分子聚集體和單個分子的鏈寬W和鏈高V，其中圖像亮和暗的部分分別表示果膠鏈中高和低的部分。單個分子的寬度可用軟件中的半峰寬測定，鏈寬值出現(xiàn)的次數(shù)記為頻率(Fq)。每組利用多個平行樣品得到統(tǒng)計結果[12]。

1.3.5 細胞壁相關酶活性的測定

長棗切丁后，立即將果肉冷凍在液氮中，并貯存在-80 ℃下，用于細胞壁及降解酶活力的測定。取3.0 g長棗果實進行粗酶液提取。PG、PME、CE、β-Gal的提取均參照曹建康等[10]的方法。

1.3.5.1 PG活力測定

參照徐曉波[13]的測定方法，并略加修改。

1.3.5.2 PME活力測定

參照ZHANG等[14]的方法，并略加修改。

1.3.5.3 CE活力測定

參照曹建康等[10]的測定方法，并略加修改。

1.3.5.4 β-Gal活力測定

參照GWANPUA等[15]的測定方法，并略加修改。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel進行統(tǒng)計分析，使用軟件DPS 9.50[16]在參數(shù)之間進行了Pearson相關性分析以及鄧肯式多重差異分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)，結果以平均值±標準差表示，并采用Origin 2019繪圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏期間長棗硬度變化規(guī)律

硬度是衡量鮮食靈武長棗質構品質的重要指標。隨著貯藏時間的延長，長棗果實硬度顯著降低，且前8 d為快速軟化期。如圖1所示，貯藏期間靈武長棗硬度介于63.07～70.69 N，0 d時的硬度為70.69 N，分別是4、8、12、16 d的1.03、1.09、1.10、1.12倍。

圖1 靈武長棗貯藏期間硬度的變化Fig.1 Changes in hardness during storage of Lingwu long jujube 注：同一指標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 貯藏期間棗果水分遷移規(guī)律

貯藏過程中，伴隨著長棗果實硬度的降低，長棗細胞內水分發(fā)生了遷移。圖2為靈武長棗序列反演獲得的T2水分典型峰型圖，T2譜中有3個波峰，T2值越小，越靠近圖的左側分布，棗果的水分活度越低。由于液泡膜和原生質膜阻礙了水分的遷移，因而水分的弛豫時間有明顯的間隔。根據(jù)T2弛豫時間的差異，可將長棗中的水分劃分為3種狀態(tài)，分別標記為T21(0.01～3.51 ms)、T22(3.51～37.64 ms)、T23(37.64～932.60 ms)[17]，即細胞壁水、細胞質水和液泡水，其對應的峰面積分別為A21、A22、A23。

圖2 靈武長棗T2水分峰型圖Fig.2 Water peak pattern of T2 of Lingwu long jujube

T2弛豫的相對峰面積可以表征不同結合狀態(tài)的水分含量。峰面積的變化可以反映出水分之間的相互轉化及其遷移[18]。圖3為靈武長棗在貯藏過程中A21、A22、A23的變化趨勢圖。前4 d，細胞壁水水分含量基本不變，第4天開始顯著下降(P<0.05)。細胞質水水分含量在4 d前緩慢上升，4～8 d內快速升高，第8天達到峰值，存在顯著差異(P<0.05)。液泡水水分含量隨著貯藏時間的延長，整體呈下降趨勢，差異顯著(P<0.05)。這可能是因為第4天時大分子物質降解，細胞壁水轉化為細胞質水，第8天時細胞質水轉變?yōu)橐号菟?/p>

2.3 貯藏期間長棗果實細胞壁多糖組成的變化規(guī)律

果膠、半纖維素和纖維素是構成細胞壁的主要成分，在果實貯藏期間，WSP、CSP、堿溶性果膠(sodium carbonate-soluble pectin，SSP)表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。如表1所示，隨著貯藏時間的延長，WSP含量逐漸升高，差異顯著(P< 0.05)。CSP含量先增加后降低。SSP、HC、CE含量變化趨勢相近，均在第4天時達到最高，隨后呈下降趨勢，在第8～12天貯藏期內急劇下降，表明細胞壁結構受損，果實軟化[19]。

a-A21、A22變化曲線；b-A23變化曲線圖3 A21、A22、A23隨貯藏時間變化曲線Fig.3 A21、A22、A23 changes of storage time

表1 靈武長棗貯藏期間細胞壁物質降解規(guī)律單位：mg/100g FW

2.4 貯藏期間長棗果實細胞壁降解酶活性

棗果采摘后，仍保持著一定的生理活性。PG主要通過水解細胞壁內存在的多聚半乳糖醛酸中的α-1,4-半乳糖苷鍵，從而導致細胞壁結構解體，使果實軟化。如圖4-a所示， 隨著貯藏期的延長，伴隨著棗果硬度的降低，PG含量整體呈上升趨勢，第12天到達果實含量最高點后略有下降，差異顯著(P<0.05)。β-Gal活力整體呈“升-降-升”的趨勢，并存在顯著性差異(P<0.05)，貯藏末期β-Gal含量是貯藏初期的1.81倍。

a-PG、β-Gal活性變化；b-PME、CE活性變化圖4 靈武長棗貯藏期間酶活性的變化Fig.4 Changes of enzyme activity during storage of Lingwu long jujube

PME能夠催化果實內聚半乳糖醛酸甲酯的酯鍵水解，形成果膠酸。如圖4-b所示，隨著貯藏期的延長，PME活力呈上升趨勢，差異顯著(P<0.05)。CE主要功能是分解含1,4-β-葡萄糖基鏈的半纖維素基質多糖[20]，隨著貯藏期的延長，長棗的CE含量由13.35 U/g逐漸上升至40.12 U/g，差異顯著(P<0.05)。棗貯藏過程中，細胞壁降解酶的變化及其協(xié)同作用，是造成棗果宏觀硬度降低、質構品質劣變的主要因素。

2.5 棗果硬度、細胞壁組分及其降解酶活力之間的相關分析

水分含量、細胞壁組分及其降解酶與果實硬度的相關性研究如表2所示。果實硬度與細胞壁水水分含量、液泡水水分含量及HC含量呈極顯著正相關，與WSP、CSP、PG、PME、β-Gal、CE含量呈極顯著負相關。各相關指標與硬度的相關程度依次為：WSP(-0.97)=CSP(-0.97)=β-Gal (-0.97)>A23(0.96)、PG(-0.96)=CE (-0.96)>A21(0.94)>PME(-0.93)>HC(0.87) >CE (0.770 0) >SSP(0.460 0)>A22(-0.180 0)。

表2 不同貯藏期紅棗果實硬度與各指標的相關性Table 2 Correlation between fruit hardness and index of jujube in different storage period

2.6 棗果硬度、細胞壁組分及其降解酶活力之間的通徑分析

為進一步分析各指標對長棗硬度所起的真正作用，對其進行通徑分析。結果如表3所示，各因素對棗果硬度的直接通徑系數(shù)大小依次為CSP (-0.492 8)>β-Gal(-0.281 3)>A23(0.262 4)。對棗果硬度的貢獻率大小依次為CSP (0.478 0)>β-Gal (0.272 9)>A23(0.251 9)，與直接通徑系數(shù)相一致。其中CSP和β-Gal活性對棗果硬度下降起促進作用，而A23起正向作用，有利于減緩紅棗果實硬度的下降，上述因素決定了長棗硬度變異的99.979%，同時有0.014%的變異是由其他因素和試驗誤差引起的。

表3 不同貯藏期紅棗果實硬度與各指標的通徑分析Table 3 Hardness of jujube fruit in different storage periods and its path analysis

2.7 細胞壁多糖的納米結構變化

為了進一步從微觀角度解析長棗貯藏過程中硬度變化的機理，以AFM進行CSP降解的形態(tài)學研究。如圖5所示，棗果貯藏初期CSP分子以聚集體結構(圖5-A中“P”)，豐富的長鏈結構及復雜的支鏈結構(圖5-A中的“Lc”“Br”)形式存在。貯藏末期的聚集體結構，長鏈結構較初期的明顯減少，大多以短鏈結構存在。表4給出了CSP分子的鏈寬及鏈高分布，貯藏初期的鏈寬值大多集中在35.156～58.594 nm，最高達到78.125 nm，對應的鏈高值大多在2 nm左右。而在貯藏末期，隨著聚集體與長鏈的減少、支鏈的增加，短鏈(15.625、19.531、23.438、31.252 nm)，出現(xiàn)的次數(shù)及頻率均有所增加，與初期存在較大的差異，表明CSP在貯藏過程中降解顯著。

表4 貯藏期間靈武長棗CSP鏈寬度的頻率和高度Table 4 Frequency and height of CSP chain width

3 結論與討論

果實軟化是果實衰老的重要特征之一，棗果軟化是由多種細胞壁降解酶協(xié)同作用下促使細胞壁多糖降解而引起細胞壁結構發(fā)生變化所導致，最后降低了硬度，水分遷移發(fā)生變化。本研究結果表明，在靈武長棗貯藏過程中，伴隨著棗果硬度的降低，細胞壁降解酶活性增加，從而引起細胞壁多糖降解，網(wǎng)絡結構破壞，水分遷移。CSP、β-Gal和液泡水水分含量對棗果軟化衰老起著重要作用。CSP與β-Gal對棗果硬度下降起促進作用，彭勇等[21]在桃的研究中發(fā)現(xiàn)，桃在貯藏期間，隨著桃硬度的下降、細胞壁發(fā)生降解，與本文研究結果一致；液泡水水分含量的降低使果實硬度下降，這與王娟等[22]研究結果一致。PG、PME、CE和β-Gal等細胞壁修飾酶均隨貯藏時間的延長呈上升狀態(tài)，且對棗果硬度有一定的影響。有研究表明[23]，β-Gal可以降解果膠多聚醛酸側鏈的半乳糖殘基，改變分子鏈的結構，使得細胞壁膨脹，結合水減少，自由水增多。本實驗中，棗果的β-Gal活性在貯藏前期出現(xiàn)了高峰，可以推測該酶可能在棗果軟化前期起重要作用。

以AFM對CSP降解的形態(tài)學研究表明，貯藏初期與末期，棗果的CSP存在較大差異。貯藏初期棗果的CSP分子以聚集體、長鏈及支鏈結構形式存在，其鏈寬值大多集中在35.156～58.594 nm，最高達到78.125 nm，對應的鏈高值大多都在2 nm左右。伴隨著棗果硬度的下降，貯藏末期的聚集體結構，長鏈結構較初期的明顯減少，短鏈(15.625、19.531、23.438、31.252 nm)出現(xiàn)的次數(shù)及頻率均有所增加，與初期存在較大的差異，表明CSP在貯藏過程中降解顯著。CSP結構變化是引起長棗硬度降低的主要因素。綜上所述，靈武長棗在采后貯藏過程中，伴隨細胞壁降解酶活性的增加，引起細胞壁多糖的降解，破壞了細胞壁網(wǎng)絡結構，水分與硬度也同步發(fā)生變化。相關分析結果表明，CSP、β-Gal和液泡水水分含量是影響棗果硬度的主要因素，為靈武長棗貯藏保鮮技術的開發(fā)提供了理論支持。