付楊，席俊，陳慧彬，陳陽

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州，450001)

大豆起源于亞洲，是一種被大面積種植的油料作物，蛋白質(zhì)含量約占大豆總質(zhì)量的40%[1]。大豆富含異黃酮和葉酸，能對人體健康產(chǎn)生有益的影響[2]，而被加工成各類食品，在全球范圍內(nèi)被廣泛食用。但大豆也是最容易導(dǎo)致人體過敏的八大食品之一[3]，過敏患者會出現(xiàn)蕁麻疹、哮喘、腸道綜合征等反應(yīng)，嚴(yán)重時還會造成休克威脅生命[4]。HELM等[5]發(fā)現(xiàn)大豆中獨特的蛋白質(zhì)可能是大豆過敏反應(yīng)的原因，尤其是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。大豆球蛋白致敏性主要取決于其單體組成亞基的過敏性，大豆球蛋白亞基在還原條件下可以解離為一條酸性多肽鏈A(30～45 kDa)和一條堿性多肽鏈B(18～20 kDa)[6]，大豆球蛋白A1a(Glycinin A1a)是大豆球蛋白G1亞基中的酸性多肽，DJURTOFT等[7]也證明免疫球蛋白E可以和所有的酸性亞基結(jié)合，現(xiàn)有報道表明大豆蛋白的致敏性源自于其酸性亞基，但Glycinin A1a亞基的具體線性B細(xì)胞表位未見報道。本實驗是對Glycinin A1a亞基上最有可能的B細(xì)胞表位進行預(yù)測。

過敏反應(yīng)的產(chǎn)生要依靠免疫細(xì)胞對抗原分子的特定部位即抗原決定簇完成識別[8]，作為抗原中的線性片段或構(gòu)象結(jié)構(gòu)，B細(xì)胞表位能被抗體特異性識別，因此成為表位預(yù)測的重要部分。對于抗原表位的鑒定、預(yù)測，李俊慧等[9]總結(jié)了一些現(xiàn)有常用生物信息學(xué)方法和軟件。利用生物信息學(xué)軟件對蛋白組學(xué)和基因組學(xué)的原件進行模型建立，同時以數(shù)據(jù)庫中已收錄的各種抗原信息為依據(jù)，對待研究的過敏原線性表位進行篩選和預(yù)測。最后使用生物學(xué)知識和免疫學(xué)實驗來確定預(yù)測的表位是否具有功能性，這種多學(xué)科交叉的方法，不僅節(jié)約大量的人力物力，加快實驗進程，而且拓展了表位預(yù)測的技術(shù)平臺，為預(yù)測更多未知的抗原表位提供了可能。劉陽星月等[10]通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank，PDB)和系列生物預(yù)測軟件、在線網(wǎng)站成功預(yù)測出大豆過敏原11S球蛋白G2中A2鏈的結(jié)合表位。閆慧麗等[8]利用SWISS-MODEL和Deep View 4.1完成了大豆主要過敏原Gly m Bd 28K的同源建模和評估，預(yù)測出6個構(gòu)象表位相關(guān)區(qū)段。皮江一等[11]也憑借該方法預(yù)測出了大豆主要過敏原β-伴大豆球蛋白β亞基的抗原表位，并以此為基礎(chǔ)對預(yù)測表位區(qū)域進行了分段克隆，抗原表位的預(yù)測成為后續(xù)抗原位置鑒定的重要前提。本研究以美國國家生物信息技術(shù)中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中得到的Glycinin A1a亞基氨基酸序列為原材料，以Glycinin A1a的高同源性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為模板，生成Glycinin A1a三維模型。用軟件DNAStar、SOPMA、ABCpred和BepiPred 1.0 server、DiscoTope 2.0 server分別進行線性表位和構(gòu)象表位的預(yù)測。為后期大豆球蛋白免疫檢測提供理論參考；準(zhǔn)確定位大豆球蛋白亞基的過敏位點，就可以有針對性的對過敏位點進行加工處理，為開發(fā)降低、消除大豆過敏性的食品加工技術(shù)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

使用NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫查找出Glycinin A1a亞基所對應(yīng)的氨基酸序列。該序列共有287個氨基酸排列如下：

FSSREQPQQNECQIQKLNALKPDNRIESEGGLIE-TWNPNNKPFQCAGVALSRCTLNRNALRRPSYTNGPQIYIQQGKGIFGMIYPGCPSTFEEPQQPQQRGQSS-RPQDRHQKIYNFREGDLIAVPTGVAWWMYNNEDT PVVAVSIIDTNSLENQLDQMPRRFYLAGNQEQE-FLKYQQEQGGHQSQKGKHQQEEENEGGSILSGFTL-EFLEHAFSVDKQIAKNLQGENEGEDKGAIVTVKGGL-SVIKPPTDEQQQRPQEEEEEEEDEKPQCKGKDKHCQ-RPRGSQSK

查找同源蛋白的PDB在線網(wǎng)站；用于三級結(jié)構(gòu)模型建立和模型穩(wěn)定性分析的軟件SWISS-MODEL和Deep View 4.1；DNAStar軟件包中的子程序Protean；其他預(yù)測軟件：SOPMA、ABCpred、BePiPred 1.0 server和DiscoTope 2.0 server。

1.2 實驗方法

1.2.1 Glycinin A1a亞基線性表位預(yù)測

DNAStar中的Protean程序可以對氨基酸序列進行分析，包括疏水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面可及性[12]。因為所測指標(biāo)與抗原表位密切相關(guān)，準(zhǔn)確性也更強，具有較高的參考價值。

SOPMA是在線網(wǎng)站預(yù)測工具，打開網(wǎng)站頁面直接將Glycinin A1a亞基氨基酸序列以FASTA格式粘貼在序列框內(nèi)，選用默認(rèn)的預(yù)測參數(shù)，提交序列可得到結(jié)果。

BepiPred 1.0預(yù)測服務(wù)器基于隱馬爾可夫模型的組合和傾向量表方法對B細(xì)胞表位預(yù)測[13]。操作方法與SOPMA相類似。

ABCpred所預(yù)測的表位氨基酸數(shù)量是相等的，排列的順序是根據(jù)表位的可能性大小，預(yù)測準(zhǔn)確性相對其他軟件較低，作為參考。使用參數(shù)參照劉陽星月等[10]的方法。

1.2.2 Glycinin A1a亞基同源建模及三維模型穩(wěn)定性評估

根據(jù)Glycinin A1a亞基的氨基酸序列在PDB網(wǎng)站上查找出相應(yīng)的同源蛋白，以同源性最高的蛋白作為模板[14]，將兩者的氨基酸序列都輸入SWISS-MODEL的序列框中，采用Target-Template Alignment模式建立模型，建立的三維模型保存為PDB文件。打開Deep View4.1軟件，在“File”選項下打開模型PDB文件；在工具欄“wind”選項中點擊“Ramachandran Plot”即可得到建立模型的拉氏圖。

1.2.3 GlycininA1a亞基構(gòu)象表位預(yù)測

使用DiscoTope 2.0 Server在線軟件，選擇導(dǎo)入的文件為同源建模保存的模型PDB文件，參數(shù)使用默認(rèn)值-3.7，提交文件即可預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Glycinin A1a亞基的線性表位預(yù)測結(jié)果

2.1.1 DNAStar

使用DNAStar中的子程序Protean預(yù)測Glycinin A1a亞基的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面可及性如圖1所示。由于抗原位點是那些被抗體識別的位點，這些位點很可能是容易接觸或在蛋白質(zhì)表面的，這些區(qū)域要比內(nèi)部區(qū)域更具流動性，由此推測它們是親水的，親水性越強，越容易和抗原表位結(jié)合。蛋白氨基酸殘基多數(shù)處于親水區(qū)，且分布均勻。柔韌性體現(xiàn)在圖1中藍(lán)色矩形覆蓋區(qū)，柔韌性和表面可及性較強時易于折疊、彎曲，能夠促進二級結(jié)構(gòu)的形成可作為預(yù)測的重點區(qū)段[15]?？乖笖?shù)是直接就其抗原可能性預(yù)測，選擇抗原指數(shù)>0的區(qū)域作為預(yù)測的表位。預(yù)測時將這4種指標(biāo)中可能性較高區(qū)段進行綜合比對，同時符合4種指標(biāo)要求的序列，更有機會被視為表位。以上預(yù)測結(jié)果如表1所示。

圖1 DNAStar分析結(jié)果Fig.1 DNAStar analysis results

2.1.2 SOPMA

SOPMA可以計算出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲所占的百分比，如圖2所示。Glycinin A1a亞基中無規(guī)則卷曲氨基酸殘基含量最高占50.52%，α-螺旋是由24.74%氨基酸殘基構(gòu)成，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊所含的氨基酸殘基分別占16.72%和8.01%。在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋和β折疊一般不作為抗原表位[16-19]，因為氫鍵的存在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易變形，而且α螺旋和β折疊通常位于蛋白內(nèi)部，不易與受體接觸。而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲一般位于蛋白質(zhì)表面，為了滿足蛋白質(zhì)的功能需要，表面結(jié)構(gòu)必須進行適當(dāng)?shù)母淖円哺菀妆蛔R別與抗原表位結(jié)合，是致敏表位的幾率更大。由此結(jié)果預(yù)測的表位如表2所示。

表1 DNAStar 預(yù)測的抗原表位Table 1 Predicted antigen epitope by DNAStar

圖2 SOPMA分析的大豆球蛋白A1a二級結(jié)構(gòu)結(jié)果Fig.2 Secondary structure of the Glycinin A1a analyzed by SOPMA

2.1.3 BepiPred

BepiPred 1.0在線網(wǎng)站預(yù)測表位得到的結(jié)果如表3所示。序列段長度差別較大，但得到的表位分布較為均勻，而且序列段與DNAStar和SOPMA預(yù)測的表位位置區(qū)域高度重合，表明預(yù)測結(jié)果具有較高可信度。

表2 SOPMA 預(yù)測的Glycinin A1a抗原表位Table 2 Predicted antigen epitope by SOPMA

表3 BepriPred預(yù)測的Glycinin A1a抗原表位Table 3 Predicted antigen epitope by BepriPred

2.1.4 ABC pripred

ABC pripred對Glycinin A1a亞基預(yù)測了18個線性表位，按照可能性大小如表4排列，最有可能的線性表位處于氨基酸序列的24～33位，在綜合評價時更側(cè)重于排名前4的預(yù)測表位。通過分析發(fā)現(xiàn)排名靠前的表位大部分靠近蛋白的N端。

表4 ABC pripred預(yù)測的Glycinin A1a抗原表位Table 4 Predicted antigen epitope by ABC pripred

線性構(gòu)象表位預(yù)測結(jié)果，按照劉陽星月等[10]提出的方法對4種軟件預(yù)測結(jié)果進行整合，結(jié)果如圖3所示，預(yù)測出10個可能的Glycinin A1a抗原線性表位EQPQQN、KPDNRI、NPNNK、RRPSYTNG、PQQPQQRGQS、QEQGGHQSQKGKHQQEEENE、NEGED、PPTDEQQQRP、DEKPQCKGK、RPRGS。

2.2 Glycinin A1a亞基模型的建立和穩(wěn)定性評估

同源建模是按未知結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中查找出已有的相似的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，然后將此蛋白結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，進而建立出未知結(jié)構(gòu)蛋白的模型[14]。SWISS-Model對大豆球蛋白A1a亞基建立模型找出大豆球蛋白A1a亞基的同源蛋白，結(jié)果顯示1FXZ(大豆球蛋白A1aB1b同源三聚體)與Glycinin A1a亞基同源性高達(dá)71%。以1FXZ為模板對大豆球蛋白A1a亞基完成同源建模，模型顯示如圖4所示。此模型符合大豆蛋白六聚體復(fù)合物結(jié)構(gòu)。利用Deep view 4.1對建立出來的Glycinin A1a亞基模型進行穩(wěn)定性分析，得到的拉氏圖如圖5所示。

圖4 Glycinin A1a亞基預(yù)測模型Fig.4 Prediction model of the Glycinin A1a subunits

圖5 Glycinin A1a亞基Ramachandran plotFig.5 Ramachandran plot of the Glycinin A1a subunits

以Φ和Ψ為坐標(biāo)軸所組成的二維圖，來表示α碳原子和肽平面間單鍵的旋轉(zhuǎn)形成的兩面角[20]，并不是所有Φ和Ψ形成的角都適合多肽骨架，不同的氨基酸殘基能夠穩(wěn)定存在時對Φ和Ψ值是有范圍的，根據(jù)這個范圍可將二維圖分為允許區(qū)(黃色線內(nèi)區(qū)域)、最大允許區(qū)(藍(lán)色色線內(nèi)區(qū)域)和不允許區(qū)[21]。由圖5計算得到Glycinin A1a亞基的氨基酸殘基超過90%落在允許區(qū)內(nèi)，即建立的A1a亞基模型是可以穩(wěn)定存在的。

2.3 Glycinin A1a亞基構(gòu)象表位分布

使用PyMOL軟件將DiscoTope 2.0 Server預(yù)測的Glycinin A1a亞基構(gòu)象表位在模型中表示出來如圖6所示。發(fā)現(xiàn)預(yù)測的構(gòu)象表位均處于模型的表面，而且較多表位處在無規(guī)則卷曲處，符合李雪嬌等[15]的實驗結(jié)果，也正是無規(guī)則卷曲部位的獨特結(jié)構(gòu)使得預(yù)測的線性表位和構(gòu)象表位有部分重合。經(jīng)過對線性表位和構(gòu)象表位的對比發(fā)現(xiàn)：兩者雖然不是完全相同的，但是在線性表位當(dāng)中包含了部分構(gòu)象表位。表明預(yù)測結(jié)果符合已有研究：線性表位和構(gòu)象表位之間是密切相關(guān)的[22]。

a-正面；b-反面圖6 Glycinin A1a亞基構(gòu)象表位Fig.6 Glycinin A1a sub-base conformation epitope 注：紅色部分表示氨基酸數(shù)量>5個的表位，黃色部分表示 氨基酸數(shù)量≤5個的表位

3 結(jié)論

抗原表位的預(yù)測方法多種多樣，但都是基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成和物理化學(xué)性質(zhì)，在本研究中DNAStar分析了Glycinin A1a亞基的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原指數(shù)，因為這些性質(zhì)的不同是抗原表位區(qū)別于普通位點的關(guān)鍵。由于α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)不易改變且大多位于蛋白內(nèi)部難以與抗體接觸結(jié)合，不作為表位處理，相反，β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲憑借良好的柔韌性、處于表面的優(yōu)勢可以較好的被識別，也成為表位預(yù)測的重要指標(biāo)。最終得到了10個可能性較高的線性表位：24EQPQQN29、40KPDNRI45、56NPNNK60、80RRPSYTNG87、114PQQPQQRGQS123、197QEQGGHQSQKGKHQQEEENE216、247NEGED251、267PPTDEQQQRP276、285DEKPQCKGK293、299RPRGS303。本研究還對Glycinin A1a進行了構(gòu)象表位的預(yù)測。預(yù)測結(jié)果與SAEED等[23]的實驗結(jié)果相符合，即抗原構(gòu)象表位位于3D模型的表面。符合一般表位預(yù)測原則，處于表面的位點可以更好的與抗體嵌合。

此實驗為接下來的Glycinin A1a過敏性表位的篩選和鑒定提供了數(shù)據(jù)支持，能更有針對性的去驗證各個表位的免疫原性。也為改善加工條件，降低大豆致敏性提供理論支持。此研究借助機器預(yù)測抗原表位，避免了大量時間，人力和濕實驗的耗費[24]。更重要的是并在沒有人為干預(yù)的情況下對未知數(shù)據(jù)進行預(yù)測。大大降低了實驗的誤差。