張麗柯，馬磊，史芳瑜，徐全曉

本研究價值：

目前，用于評估胃癌進展情況和患者預(yù)后的常用指標(biāo)〔如國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期〕并未考慮患者整體免疫狀態(tài)，而胃癌組織細胞程序性死亡配體1（PD-L1）表達情況和 CD8+腫瘤浸潤T淋巴細胞（TILs）密度是否可用于評估胃癌患者預(yù)后尚不明確。本研究證實高水平PD-L1 mRNA、低密度CD8+TILs均是胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素，有望成為胃癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。

胃癌是全球范圍內(nèi)第五大常見惡性腫瘤，而在癌癥相關(guān)死亡原因中，胃癌位居第三［1］。近年研究表明，多數(shù)胃癌與幽門螺桿菌、Epstein-Barr（EB）病毒感染及慢性炎癥有關(guān)，而靶向免疫系統(tǒng)治療是一種十分有應(yīng)用前景的胃癌治療方法［2-4］；細胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）與其受體細胞程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）結(jié)合后可抑制T細胞遷移、增殖及細胞毒性遞質(zhì)分泌，最終通過減弱效應(yīng)T細胞功能而限制其對腫瘤細胞的殺傷作用［5］。

PD-L1通常在免疫細胞（如巨噬細胞和樹突狀細胞）中表達，在多種腫瘤（如黑色素瘤、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌）細胞中亦有表達［6-8］。研究表明，腫瘤細胞對PD-L1的調(diào)節(jié)機制主要包括內(nèi)在免疫抵抗和適應(yīng)性抵抗，腫瘤細胞中PD-L1表達上調(diào)并與腫瘤浸潤T淋巴細胞（tumour-infiltrating lymphoeytes，TILs）表達的PD-1相互作用，從而負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，造成腫瘤免疫逃逸［9］。因此，了解腫瘤細胞免疫狀態(tài)對評估患者預(yù)后和免疫治療的生物標(biāo)志物篩選均有一定指導(dǎo)價值。本研究旨在分析胃癌組織PD-L1表達情況、CD8+TILs密度及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2016年1月至2018年3月在南陽市第一人民醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌患者125例，其中男76例、女49例；年齡40～65歲，平均年齡（57.1±8.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)胃鏡活檢和術(shù)后病理檢查確診為胃癌；（2）行胃癌根治術(shù)；（3）術(shù)前未接受過新輔助化療；（4）初次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他惡性腫瘤；（2）感染性疾??；（3）免疫系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)南陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：20210545），所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 臨床病理特征 回顧性分析所有患者臨床病理特征，包括年齡、性別、手術(shù)類型、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、脈管侵犯情況、腹膜轉(zhuǎn)移情況等。

1.2.2 預(yù)后 通過電話對所有患者進行隨訪以分析患者預(yù)后，隨訪起始時間為手術(shù)結(jié)束，終止時間為術(shù)后36個月，以患者死亡或失訪為終點事件；以隨訪期間患者死亡為預(yù)后不良，隨訪36個月患者仍生存為預(yù)后良好。

1.2.3 PD-L1 mRNA相對表達量 收集所有患者胃癌組織標(biāo)本并放置于-80 ℃冰箱中保存。采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測所有患者胃癌組織PD-L1 mRNA表達水平：（1）利用TRIZOL試劑提取總RNA，并采用紫外分光光度計檢測樣品濃度及純度以確保樣本合格；（2）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并根據(jù)TaKaRa實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作；（3）以管家基因U6 mRNA作為內(nèi)參照（上游引物序列為5'-GGTT CTAGCTATGGTATCGCTTCAAT-3'，下游引物序列為5'-GCGTCTGGTGATAGTCTGCAGAGT-3'），PD-L1上游引物序列為5'-TTGGGAAATGGAGGATAAGAACA-3'，下游引物序列5'-TGTTGTATGGGGCATTGACT-3'；（4）設(shè)置總反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，40個循環(huán)；（5）采用2-ΔΔCt 法計算PD-L1 mRNA相對表達量，并以PD-L1 mRNA相對表達量的平均值為臨界值，小于該臨界值者歸為低水平組，等于或大于該臨界值者歸為高水平組。

1.2.4 CD8+TILs密度 采用免疫組化方法檢測所有患者胃癌組織CD8+TILs密度：（1）將胃癌組織石蠟標(biāo)本制備成4 μm厚的連續(xù)切片并進行梯度脫蠟和水化處理，晾干后滴加3%過氧化氫溶液，室溫放置10 min；（2）切片用磷酸鹽（PBS）溶液沖洗后放置于檸檬酸鹽緩沖液中浸泡，采用微波加熱20 min以修復(fù)抗原，自然冷卻后用PBS溶液沖洗并滴加一抗（兔抗人重組anti-CD8單克隆抗體，抗體終濃度為1∶50），4 ℃冰箱中孵育、過夜；（3）切片再次用PBS溶液沖洗后滴加抗兔的二抗，室溫放置1 h后采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進行避光顯色，采用光學(xué)顯微鏡觀察切片，發(fā)現(xiàn)組織黃染時終止顯色；（4）在癌巢區(qū)隨機選取3個CD8+細胞豐富區(qū)域并計算CD8+TILs數(shù)量，并以癌巢內(nèi)CD8+TILs數(shù)量的平均值作為臨界值，小于該臨界值者歸為低密度組，等于或大于該臨界值者歸為高密度組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。本研究計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗；胃癌組織PD-L1 mRNA相對表達量與CD8+TILs密度的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；繪制Kaplan-Meier曲線以進行生存分析，采用Log-rank檢驗；胃癌患者預(yù)后的影響因素分析采用單因素和多因素Cox回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織PD-L1 mRNA相對表達量、CD8+TILs密度 所有患者胃癌組織平均PD-L1 mRNA相對表達量為3.1，癌巢內(nèi)平均CD8+TILs數(shù)量為36個，最終歸為低水平組73例和高水平組52例，低密度組55例和高密度組70例。

2.2 胃癌組織PD-L1 mRNA相對表達量、CD8+TILs密度與患者臨床病理特征的關(guān)系 低水平組與高水平組患者年齡、性別、手術(shù)類型、分化程度、浸潤深度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、腹膜轉(zhuǎn)移情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；低密度組與高密度組患者年齡、性別、手術(shù)類型、分化程度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、腹膜轉(zhuǎn)移情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 胃癌組織PD-L1 mRNA相對表達量、CD8+ TILs密度與患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relations of relative expression quantity of PD-L1 mRNA，density of CD8+ TILs in gastric cancer tissues with clinicopathological characteristics of patients with gastric cancer

2.3 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織PD-L1 mRNA相對表達量與CD8+TILs密度呈負相關(guān)（r=-0.412，P<0.001）。

2.4 生存分析 所有患者隨訪2～36個月，中位隨訪時間為36.0個月；125例患者中預(yù)后不良37例，預(yù)后良好88例。低水平組與高水平組、低密度組與高密度組患者Kaplan-Meier曲線比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2值分別為8.189、5.154，P值分別為0.004、0.023），見圖1、2。

圖1 不同PD-L1 mRNA相對表達量胃癌患者的Kaplan-Meier曲線Figure 1 Kaplan-Meier curve of gastric cancer patients with different relative expression quantity of PD-L1 mRNA

圖2 不同CD8+ TILs密度胃癌患者的Kaplan-Meier曲線Figure 2 Kaplan-Meier curve of gastric cancer patients with different density of CD8+ TILs

2.5 單因素和多因素Cox回歸分析 以臨床病理特征為自變量，以預(yù)后為因變量進行單因素Cox回歸分析（變量賦值見表2），結(jié)果顯示，年齡、浸潤深度、脈管侵犯、腹膜轉(zhuǎn)移、高水平PD-L1 mRNA、低密度CD8+TILs是胃癌患者預(yù)后的影響因素（P<0.05），見表3；以單因素Cox回歸分析結(jié)果中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，以預(yù)后為因變量進行多因素Cox回歸分析（變量賦值同上），結(jié)果顯示，浸潤深度為T3～T4、脈管侵犯、腹膜轉(zhuǎn)移、高水平PD-L1 mRNA、低密度CD8+TILs為胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素（P<0.05），見表3。

表2 胃癌患者預(yù)后影響因素單因素和多因素Cox回歸分析的變量賦值Table 2 Variable assignment of univariate and multivariate Cox regression analysis of factors affecting prognosis of patients with gastric cancer

表3 胃癌患者預(yù)后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析Table 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of factors affecting prognosis of patients with gastric cancer

3 討論

胃癌細胞中PD-L1表達情況可能是抗PD-L1免疫治療的有效生物標(biāo)志物，檢測胃癌組織PD-L1表達情況具有重要臨床意義，但目前關(guān)于PD-L1表達情況對胃癌患者預(yù)后的影響尚存在爭議：B?GER等［10］研究認為腫瘤細胞PD-L1陽性的胃癌患者預(yù)后良好，但CHANG等［11］研究認為PD-L1高表達是胃癌患者預(yù)后不良的危險因素之一，KAWAZOE等［12］則研究認為PD-L1與胃癌患者預(yù)后無關(guān)。THOMPSON等［13］研究結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織PD-L1陽性表達率約為44.0%；本研究結(jié)果顯示，41.6%（52/125）的胃癌患者癌組織PD-L1 mRNA呈高表達，與THOMPSON等［13］研究結(jié)果接近，進一步行多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，高水平PD-L1 mRNA為胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素之一。

研究表明，PD-L1在多種腫瘤（如黑色素瘤、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌及胰腺癌）細胞中呈陽性表達，在正常組織中幾乎不表達，腫瘤細胞PD-L1表達上調(diào)的機制可能與固有表達及適應(yīng)性免疫抵抗有關(guān)［6-8，14］，其中固有表達指腫瘤細胞通過癌基因上調(diào)PD-L1的表達并常在腫瘤細胞中呈彌漫性分布；適應(yīng)性免疫抵抗指腫瘤細胞特異性抗原被T細胞識別時T細胞受體信號產(chǎn)生干擾素，進而誘導(dǎo)PD-L1的表達上調(diào)，此時PD-L1多在癌組織T細胞富集區(qū)表達，尤以腫瘤侵襲邊緣為高［15-16］。

由于CD8+T淋巴細胞可誘導(dǎo)癌組織抑制性受體表達并導(dǎo)致CD8+T淋巴細胞功能障礙和凋亡，因為其也被稱為耗竭的CD8+T淋巴細胞，而此耗竭過程會導(dǎo)致可殺死腫瘤細胞的CD8+T淋巴細胞數(shù)量不足，進而造成腫瘤快速進展，包括腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等［17］。已有研究證實PD-1在耗竭的T細胞上表達，并是惡性腫瘤細胞用來逃避遭破壞的免疫逃逸的主要機制［18］。PD-L1通常被巨噬細胞、活化的淋巴細胞〔包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞〕、腫瘤細胞作為生理過程的一部分，可下調(diào)宿主免疫反應(yīng)［19-20］，CD8+T淋巴細胞直接參與腫瘤免疫反應(yīng)并可直接殺傷表達腫瘤抗原的腫瘤細胞，因此PD-L1既是靶點又是免疫調(diào)節(jié)劑，可通過調(diào)節(jié)T細胞免疫功能發(fā)揮作用。

BURRACK等［21］通過結(jié)合癌組織PD-L1表達情況和CD8+TILs密度而評估宮頸癌患者免疫環(huán)境和預(yù)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織PD-L1表達水平和CD8+TILs密度呈負相關(guān)。本研究進行的Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織PD-L1 mRNA相對表達量與CD8+TILs密度呈負相關(guān)，提示胃癌組織PD-L1表達上調(diào)會抑制CD8+T淋巴細胞誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果還顯示，低水平組與高水平組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、腹膜轉(zhuǎn)移情況存在統(tǒng)計學(xué)差異，低密度組與高密度組患者浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、腹膜轉(zhuǎn)移情況亦存在統(tǒng)計學(xué)差異，提示PD-L1與CD8+TILs參與胃癌進展和轉(zhuǎn)移；低水平組與高水平組、低密度組與高密度組患者Kaplan-Meier曲線間存在統(tǒng)計學(xué)差異，且多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示高水平PD-L1 mRNA、低密度CD8+TILs為胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。

目前，臨床上常通過國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期判斷惡性腫瘤進展情況及患者預(yù)后，但該分期并未考慮患者整體免疫狀態(tài)及癌組織免疫特性，近年來已有研究機構(gòu)試圖在臨床上推廣免疫評分并將免疫評分整合入TNM分期［22］。本研究證實胃癌組織免疫微環(huán)境與患者預(yù)后密切相關(guān)，高水平PD-L1 mRNA和低密度CD+8TILs均是胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素，有望成為胃癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，因此，建議胃癌患者常規(guī)檢測PD-L1表達情況和CD8+TILs密度，以更好地判斷胃癌患者預(yù)后，但本研究為單中心研究且樣本量較小，代表性有限，PD-L1表達情況和CD8+TILs密度用于評估胃癌患者預(yù)后的可行性、可靠性等仍需擴大樣本量進一步驗證。

作者貢獻：張麗柯負責(zé)文獻的檢索、研究的設(shè)計及文章撰寫；馬磊、史芳瑜進行數(shù)據(jù)收集、采集、清洗和統(tǒng)計學(xué)分析，并負責(zé)制作圖表；徐全曉對文章知識性內(nèi)容進行批判性審閱并提供材料支持，進行文章質(zhì)量控制和審校，對文章整體負責(zé)。所有作者確認了論文最終稿。

本文無利益沖突。