錢(qián)金珠，梁 明，余 意，鄧亞雷，劉史佳，龐會(huì)明，戚 進(jìn)*

（1中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 211198；2無(wú)限極(中國(guó))有限公司，廣州 510405；3江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210029）

何首烏（Polygonum multiflorumThunb）為蓼科植物何首烏的塊根，始載于《開(kāi)寶本草》，為我國(guó)傳統(tǒng)的知名中藥［1-2］。制首烏為何首烏生品的炮制加工品，現(xiàn)代炮制方法主要包括黑豆蒸制法、黑豆黃酒蒸制法和高壓清燉法。制首烏善補(bǔ)肝腎、益精血，臨床多取其滋補(bǔ)功能入藥［3-5］?，F(xiàn)代研究表明，何首烏具有抗氧化、抗衰老、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用?？寡趸呛问诪踔饕乃幚碜饔弥?，也是其具有抗衰老等其他藥理作用的可能原因。目前對(duì)于何首烏的抗氧化活性和化學(xué)成分已有大量的研究報(bào)道，其中酚酸類(lèi)、二苯乙烯苷類(lèi)和蒽醌類(lèi)等類(lèi)型的化學(xué)成分被認(rèn)為是何首烏中的主要抗氧化成分類(lèi)型［6-9］，但是對(duì)于不同類(lèi)型化合物中各有哪些具體成分與何首烏特別是制首烏的抗氧化活性相關(guān)聯(lián)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

對(duì)于抗氧化活性物質(zhì)的測(cè)定方法主要有傳統(tǒng)模式和在線(xiàn)模式兩種。傳統(tǒng)模式抗氧化活性測(cè)定方法如：清除羥自由基法（·OH）、超氧陰離子法（O2?-）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法（DPPH）法、H2O2法、Fe3+還原（FRAP）法等，通常用于中藥提取物中一組成分的總抗氧化能力的測(cè)定，對(duì)于單一成分的抗氧化活性測(cè)定，則往往需要大量的分離純化過(guò)程［10-11］。在線(xiàn)模式抗氧化活性測(cè)定方法如HPLC-DPPH、高效液相色譜-［2，2-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽］（HPLC-ABTS+?）、高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光分析法（HPLC-CL）等，具有自動(dòng)化、穩(wěn)定化、快速化、規(guī)范化等優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)分析和評(píng)價(jià)中藥中單一成分的抗氧化活性及其對(duì)中藥總活性的貢獻(xiàn)，而減少大量的分離純化步驟［11-13］，已逐步在中藥抗氧化活性研究中得到應(yīng)用。此前本課題組曾報(bào)道采用HPLC-CL 分析方法對(duì)14 批不同產(chǎn)地的何首烏的抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)判，并確定了何首烏中主要抗氧化活性成分，但未涉及不同炮制方法的制首烏的抗氧化活性研究［14］。

課題組前期采用傳統(tǒng)模式的抗氧化活性測(cè)定方法對(duì)制首烏不同部位的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)制首烏醇部位具有較強(qiáng)的清除DPPH 作用。因此，本研究建立HPLC-DPPH 在線(xiàn)分析方法，對(duì)16 批不同炮制方法的制首烏進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，通過(guò)對(duì)各批次制首烏的抗氧化總活性以活性加和的方式進(jìn)行量化，實(shí)現(xiàn)對(duì)制首烏抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)。并明確制首烏中的主要抗氧化活性物質(zhì)，對(duì)不同炮制方法的制首烏的抗氧化活性進(jìn)行比較。

1 材 料

1.1 樣品與試劑

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，美國(guó)Sigma公司）；二苯乙烯苷（南京春秋生物有限公司，純度≥99%）；甲醇（色譜純，南京化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia 試劑公司），其余試劑均為市售分析純。16 批不同炮制方法的制首烏樣品信息見(jiàn)表1。

Table 1 Sample information of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

1.2 儀 器

LC-2010CHT 高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV 檢測(cè)器及色譜工作站（日本島津公司）；十萬(wàn)分之一天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；P230Ⅱ高壓恒流泵（大連依利特分析儀器有限公司）；pHS-25 型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

2 方 法

2.1 DPPH溶液的制備

精密稱(chēng)取DPPH 適量，溶解于甲醇中，將溶液轉(zhuǎn)移至500 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得到濃度為1×10-3mol/L的DPPH母液，4 ℃避光存放，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，50%乙醇溶解，配制成不同濃度的二苯乙烯苷溶液。

2.3 供試藥材的制備

將制首烏人工粉碎至約1 cm 塊狀，去離子水提取兩次，料液比為1∶10，合并提取液，減壓濃縮，濃縮液加無(wú)水乙醇除去多糖，將上清液濃縮，用D101 型大孔樹(shù)脂富集，依次用水和乙醇洗脫。收集醇部位，揮干溶劑，即得制首烏大孔樹(shù)脂醇部位。將16份不同炮制方法的制首烏按照上述方法制備醇部位供試品進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 HPLC-DPPH分析方法

按照?qǐng)D1 的方式將UV 與PDA 連接，色譜柱為Agela Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），基于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［14］，結(jié)合本課題組前期對(duì)不同波長(zhǎng)下色譜峰出峰情況的考察，選擇LC-10AD 檢測(cè)器波長(zhǎng)為254 nm，二極管陣列檢測(cè)器PDA 檢測(cè)波長(zhǎng)為517 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量15 μL，流動(dòng)相為0.1%磷酸水（A）和乙腈（B），洗脫程序如下：0 ~ 6 min，6% ~ 6% B；6 ~ 10 min，6% ~10% B；10 ~ 15 min，10% ~ 10% B；15 ~ 25 min，10% ~ 15% B；25 ~ 45 min，15% ~ 20% B；45 ~ 70 min，20%~30%B；70~75 min，30%~35%B；75~85 min，35% ~ 60% B；85 ~ 90 min，60% ~ 65% B；90 ~ 100 min，65% ~ 65% B；100 ~ 105 min，65% ~100%B；105~110 min，100%~100%B。

Figure 1 HPLC-DPPH on-line analyzer system

外接設(shè)備條件：P230Ⅱ外接高壓恒流泵泵入DPPH 流速0.4 mL/min，濃度1 × 10-4mol/L。PEEK管長(zhǎng)度6 m，內(nèi)徑0.1 mm。

2.5 HPLC-Q-TOF-MS條件

Agilent 1260-6530 HPLC-Q-TOF，負(fù)離子模式掃描。流動(dòng)相中將0.1%磷酸替換成0.1%甲酸。離子源參數(shù)：干燥氣（N2）溫度：350 ℃，流速，9.0 L/min；毛細(xì)管電壓，3 300 V；霧化壓力，40 psi（1 psi=6.895 kPa）；質(zhì)量掃描范圍m/z：100~1 000。

數(shù)據(jù)采集采用HPLC-Q-TOF-MS MassHunter Acquisition Software Version B.04.00 軟件，數(shù)據(jù)處理采用MassHunter Workstation Qualitative Analysis軟件Version B.06.00 軟件完成。其中元素組成測(cè)定參數(shù)設(shè)定如下：C，0~50；H，0~100；O，0~50；N，0~3；初步假定所有化合物均不含有磷，硫，溴和氯等元素；最大允許誤差范圍為±5×10-6。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC-DPPH在線(xiàn)分析條件考察

前期實(shí)驗(yàn)表明，DPPH 流速與濃度對(duì)系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度影響較大，因此以S01 批次（201506001）制首烏作為研究對(duì)象，以總倒峰峰面積為考察指標(biāo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，分別考察P230Ⅱ外接高壓恒流泵泵入DPPH 流速（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min），以及泵入DPPH 濃度（1 × 10-5、2×10-5、3.5×10-5、5×10-5、1×10-4mol/L），如圖2-A、2-B所示，在DPPH 泵入流速為0.4 mL/min，濃度為1×10-4mol/L時(shí)檢測(cè)效果最好。

PEEK管的長(zhǎng)度可直接影響樣品與DPPH的反應(yīng)時(shí)間，管長(zhǎng)越長(zhǎng)，反應(yīng)越完全，系統(tǒng)壓力也越大，因此以系統(tǒng)能承受最大壓力為考察限度，選擇PEEK管的長(zhǎng)度為6 m進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2-C）。

此外，PEEK 管的內(nèi)徑可影響活性峰的展寬，對(duì)PEEK 管內(nèi)徑（0.1 mm、0.5 mm）進(jìn)行考察，結(jié)果表明，PEEK 管內(nèi)徑為0.1 mm 時(shí)，峰寬為1.007；內(nèi)徑為0.5 mm 時(shí)，峰寬為4.235。因此，選擇內(nèi)徑為0.1 mm PEEK管用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 2 Effect of different flow rate(A),different concentration of DPPH(B)and different lengths of PEEK tube on(C)sample determination

3.2 不同批次制首烏醇部位抗氧化活性指紋圖譜的建立及共有峰標(biāo)識(shí)

Figure 3 HPLC chemical chromatogram with activity chromatogram of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

通過(guò)HPLC-DPPH 在線(xiàn)聯(lián)用系統(tǒng)得到不同批次制首烏樣品中的化學(xué)指紋圖譜和對(duì)應(yīng)的抗氧化活性指紋圖譜，對(duì)其進(jìn)行綜合分析，標(biāo)識(shí)出具有抗氧化活性作用的共有峰共12 個(gè)（圖3）。通過(guò)HPLC-Q-TOF-MS 對(duì)11 個(gè)抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，其中，兒茶素（catechin，峰2），2，3，5，4′-tetrahy?droxystilbene-2-O-di-glucoside（峰3），trans-2，3，5，4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside（反-2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，峰5），2，3，5，4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-（galloyl）-β-D-glucoside（2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-（沒(méi)食子酰）-β-D-葡萄糖苷，峰6、8、11），峰12對(duì)DPPH 產(chǎn)生了顯著的清除作用。從質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，制首烏抗氧化成分為酚酸類(lèi)和二苯乙烯苷類(lèi)化合物，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［16-18］。

3.3 制首烏中抗氧化物質(zhì)的活性評(píng)價(jià)

不同批次不同炮制方法的制首烏，其抗氧化活性能力各不相同，且活性無(wú)法簡(jiǎn)單加和，需建立一個(gè)可加和的活性指標(biāo)對(duì)其整體抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究以二苯乙烯苷作為陽(yáng)性參比，首先建立二苯乙烯苷清除DPPH 的峰效數(shù)學(xué)模型，x為二苯乙烯苷的量（單位：mg/mL），y為活性峰面積，建立二苯乙烯苷清除DPPH 的峰（y）與效（x）之間的函數(shù)關(guān)系：y= 280 226.05x -9 523.83x2+123.44x3+ 25 866.5（R2= 0.999 22），峰效關(guān)系方程曲線(xiàn)見(jiàn)圖4，根據(jù)峰效函數(shù)關(guān)系方程計(jì)算16批制首烏抗氧化活性，以1 mg/mL 二苯乙烯苷為一個(gè)活性單位（1 U）［19］，對(duì)16批樣品中各峰的抗氧化相對(duì)活性及其總活性進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)化學(xué)峰的峰面積對(duì)總峰面積的貢獻(xiàn)率（圖5-A）及各共有峰相對(duì)活性對(duì)總抗氧化活性的貢獻(xiàn)率（圖5-B）。圖5-A 中Peak 5、6 在大多數(shù)樣品中都顯示較高的峰面積貢獻(xiàn)度，其相對(duì)活性貢獻(xiàn)在圖5-B 顯示也很高。相反Peak 2 和Peak 8 在圖5-A 并未表現(xiàn)出較高的峰面積貢獻(xiàn)度，但在圖5-B 中依然有較高的活性貢獻(xiàn)度；圖5-A 中峰面積貢獻(xiàn)度較高的Peak 9、10 在圖5-B 中并沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的活性貢獻(xiàn)度。根據(jù)HPLC-MS 鑒定，活性較好的化合物多為二苯乙烯苷類(lèi)，而Peak 9、10為polygonumosides A 類(lèi)化合物，為二苯乙烯苷類(lèi)衍生物，雖然在何首烏中具有較高的含量，但是其并未表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。因此化合物的相對(duì)活性并不與峰面積成正相關(guān)，在抗氧化活性評(píng)價(jià)中，不適宜以化學(xué)指紋圖譜的峰面積作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)結(jié)合活性指紋圖譜共同評(píng)價(jià)為宜。

Figure 4 Peak-effect function relationship equation of standard peak area and antioxidant capacity

通過(guò)已建立的加和方法，對(duì)16 批制首烏具有抗氧化活性的12個(gè)共有峰總抗氧化活性進(jìn)行加和分析，可以更直觀地得到不同批次制首烏的抗氧化活性強(qiáng)弱（圖6-A）。以上分析剔除了活性較弱的活性峰，為了驗(yàn)證該方法是否能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)制首烏的抗氧化活性，對(duì)每批次制首烏總活性進(jìn)行加和分析，得到16 批制首烏所有活性峰總抗氧化活性（圖6-B）。通過(guò)比較分析，活性較強(qiáng)的共有峰總抗氧化活性結(jié)果與所有活性峰總抗氧化活性結(jié)果一致，證明該方法能夠反映制首烏的總體抗氧化活性，且批次S01（黑豆）、S02（黑豆）、S03（黑豆）、S09（高壓）、S11（黑豆黃酒）、S15（黑豆黃酒）表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，表明不同炮制方法均具有一定的抗氧化活性，但其結(jié)果可能與本研究所選取的高壓炮制的制首烏批次較少有關(guān)。此方法的建立在一定程度上能夠更好地評(píng)價(jià)制首烏的質(zhì)量，也為制首烏的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了新的依據(jù)。

Figure 6 Total antioxidant activity contributions of Polygoni Multiflori Radix Praeparata samples(A)and total antioxidant activity of all active peaks in Polygoni Multiflori Radix Praeparata samples(B)

4 結(jié) 論

現(xiàn)代研究表明，氧化應(yīng)激可誘發(fā)多種疾病的發(fā)生，如動(dòng)脈硬化、腫瘤、糖尿病、高血壓和代謝綜合征等疾病。制首烏具有調(diào)節(jié)造血功能、延緩衰老、改善中樞神經(jīng)退行性疾病等藥理作用。如二苯乙烯苷能改善小鼠記憶力，增加SOD 酶活性，減少血清活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）等水平，上調(diào)小鼠各臟器組織相關(guān)蛋白表達(dá)，延緩衰老［20］；作為的滋補(bǔ)中藥，制首烏在抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗衰老等多方面作用顯著［21］。因此對(duì)其抗氧化活性及質(zhì)量控制研究具有重要意義。

本研究建立了從復(fù)雜化學(xué)成分中快速遴選抗氧化活性成分的HPLC-DPPH 在線(xiàn)聯(lián)用分析方法，并對(duì)16 批3 種炮制方法的制首烏進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，結(jié)合化學(xué)指紋圖譜和活性指紋圖譜，篩選出12 個(gè)共有抗氧化活性成分，通過(guò)HPLC-Q-TOF-MS鑒別出其中11個(gè)成分，其中多為二苯乙烯苷類(lèi)、酚酸類(lèi)成分。并以二苯乙烯苷為陽(yáng)性對(duì)照，建立峰效關(guān)系模型，對(duì)各成分及各批次制首烏抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。3 種炮制方法的16 批制首烏均具有一定的抗氧化活性，表明不同炮制方法對(duì)制首烏的品質(zhì)無(wú)明顯影響，但也可能與選取的高壓炮制的制首烏批次較少有關(guān)。所建方法能夠體現(xiàn)不同批次制首烏之間抗氧化活性的差異，其中批次S01、S02、S03、S09、S11和S15表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。

本研究建立的HPLC-DPPH 在線(xiàn)聯(lián)用方法相較于傳統(tǒng)模式抗氧化活性測(cè)定方法具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)，在得到化學(xué)指紋峰的同時(shí)可得到活性指紋峰，在快速測(cè)定制首烏中主要抗氧化活性成分的同時(shí)分析其抗氧化能力，該方法進(jìn)一步結(jié)合HPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)進(jìn)行鑒別，能夠提供活性指紋峰的結(jié)構(gòu)信息，以實(shí)現(xiàn)“成分－峰－效”的綜合分析。上述研究為遴選制首烏中的抗氧化活性成分提供了一種高效、便利的方法，也為其他中藥及其炮制品的抗氧化活性成分遴選提供了參考。