魏奶杰，王廣基，張經(jīng)緯

（中國藥科大學江蘇省藥物代謝動力學重點實驗室，南京 210009）

面對重大疾病精準治療的臨床緊迫需求，生物醫(yī)藥行業(yè)正在從傳統(tǒng)的小分子化學藥物時代進入精準靶向生物藥/細胞治療藥物的個性化治療時代。其中，基于活細胞藥物的先進細胞療法被認為是醫(yī)藥治療領域的新支柱［1］。根據(jù)文獻報道，截至2021年4月16日，全球共計有2 073種在研的活細胞治療藥物［2］。作為活細胞藥物治療的成功案例之一，靶向CD19 的嵌合抗原受體（CAR）工程化T 細胞（CAR-T 細胞）的臨床使用獲批及其展現(xiàn)出的令人激動的臨床療效，為腫瘤免疫治療開啟了一個“活細胞藥物”的全新時代［3］。而更多的修飾改造的干細胞、免疫細胞、血細胞藥物以及活體微生物藥物等，正在成為未來的新興熱點。例如，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）由于能夠自我更新、可分化為各種特化細胞類型、具有免疫調(diào)節(jié)以及向受損組織分泌營養(yǎng)因子和遷移的能力［4］，在治療腦損傷［5-6］、心肌梗死［7］、肺纖維化［8-9］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［10-11］、肝纖維化［12］等疾病上具有廣闊的應用前景，目前全球范圍內(nèi)已有多個MSCs 的臨床研究結果發(fā)布，并且證實了基于MSCs 的細胞療法具有可行性和有效性?；罴毎幬锏难邪l(fā)以及治療的成功實施均需要建立在充分闡明移植后細胞體內(nèi)動態(tài)過程的基礎上。然而，移植的活細胞藥物在體內(nèi)的動態(tài)過程，如細胞的生物分布、活性、增殖、歸巢等，因研究技術和策略發(fā)展的羈絆，仍然不清楚。傳統(tǒng)的藥物吸收、分布、代謝和排泄的研究思路和方法并不完全適用于活細胞藥物的藥代動力學研究。為了更好的了解活細胞藥物在體內(nèi)的動態(tài)過程，無創(chuàng)可視化成像技術進入人們的視線，并且成為一種重要手段。通過對細胞進行探針標記，借助各種成像設備，可視化地監(jiān)測移植細胞在體內(nèi)的時間和空間分布，有助于確定最佳的移植細胞數(shù)量、優(yōu)化給藥方案、提高移植效率、增強作用的靶向性、降低潛在的靶外積累風險。

理想的活細胞藥物體內(nèi)無創(chuàng)可視化示蹤應該具備以下特點：（1）對活細胞藥物進行標記并不影響其活性、分化能力、治療功能等；（2）能夠示蹤活細胞藥物在體內(nèi)的多個生物學行為，包括活性、遷移、分布、分化等；（3）具備足夠長時間的無創(chuàng)可視化監(jiān)測能力。上述成像要求對醫(yī)學影像技術提出了挑戰(zhàn)。近年來，放射性核素成像（radionuclide imaging，RI）、磁共振成像（magnetic resonance imag?ing，MRI）、磁顆粒成像（magnetic particle imaging，MPI）、計算機斷層掃描成像（computed tomography，CT）、熒光成像（fluorescence imaging，F(xiàn)I）、光聲成像（photoacoustic imaging，PAI）等成像技術已經(jīng)被大量應用于示蹤移植的活細胞藥物，并成功用于活細胞藥物的體內(nèi)動態(tài)過程研究。本文對當前研究中的主要細胞成像示蹤技術進行綜述，旨在進一步提高活細胞藥物體內(nèi)成像能力，從而為活細胞藥物的研發(fā)及其移植治療提供更加科學的理論依據(jù)。

1 放射性核素成像技術（RI）

RI 技術主要有單光子發(fā)射斷層成像技術（single photon emission computed tomography，SPECT）和正電子發(fā)射斷層成像技術（positron emission tomography，PET）［13］。RI 技術具有較強的臨床相關性、良好的敏感性及可定量性。標記細胞用的111In，89Zr，68Ga 等作為FDA 批準使用的放射性核素成像造影劑，具有優(yōu)良的生物相容性和非免疫原性，并且兼具價格低廉、使用方便等優(yōu)點。利用這些造影劑可在體外直接對活細胞藥物進行標記，并通過放射性核素成像示蹤其在體內(nèi)歸巢和分布的動態(tài)信息［14-16］。Gholamrezanezhad 等［17］利用PET 成像技術研究了MSCs 在肝硬化患者體內(nèi)的分布變化情況。首先利用111In 在體外對MSCs 進行標記，然后通過肘正中靜脈進行移植，PET 成像結果表明，靜脈輸注后放射性信號首先在肺部顯示，然后逐漸轉(zhuǎn)移到肝和脾。但是直接標記的放射性示蹤劑的量會隨著細胞的增殖而稀釋，因此不適用于長期監(jiān)測活細胞藥物。解決這一問題較好的方法是使活細胞藥物穩(wěn)定表達PET/SPECT 成像所需的報告基因，活細胞移植后進一步在體連續(xù)輸入特定的探針，利用報告基因?qū)氲氖荏w與特定探針的相互作用對活細胞藥物進行即時成像。Minn 等［18］構建了表達前列腺特異性膜抗原（PSMA）的CD19-tPSMA（N9del）T 細胞，并使用特異性造影劑［18F］DCFPyL 進行在體PET 成像研究。利用該成像技術發(fā)現(xiàn)外周血和骨髓中的CD19-tPSMA（N9del）CAR-T細胞數(shù)量與腫瘤中的數(shù)量之間存在明顯差異，這一發(fā)現(xiàn)提示了臨床上進行無創(chuàng)、可重復監(jiān)測CAR-T 細胞分布的必要性。Emami-Shahri 等［19］則構建了表達人鈉/碘轉(zhuǎn)運體（hNIS）的CAR-T細胞，在荷瘤鼠中使用99mTcO4-放射示蹤劑進行放射性核素成像，該研究為CAR-T細胞在體內(nèi)的高分辨率連續(xù)成像提供了無創(chuàng)且快速的方法。雖然采用報告基因-特異性探針這一策略可以有效地避免示蹤劑的稀釋，但存在改變細胞功能和增加免疫原性的風險。因此，利用內(nèi)源性抗原與抗體反應的免疫PET 技術迅速發(fā)展起來，該技術兼具了單抗的高特異性和PET 顯像的高 靈 敏 度［20］。Simonetta 等［21］針 對CD19 特 異 性CAR-T 細胞的共刺激因子設計了免疫PET 成像方法，可以對CD19 特異性CAR-T 細胞在B 細胞淋巴瘤小鼠模型中的激活、擴增和靶向腫瘤浸潤進行監(jiān)測。盡管如此，在核素成像實驗中研究人員也發(fā)現(xiàn)，單一的核素成像技術無法提供解剖信息，必須與其他解剖成像方法相結合［22］，如PET/CT［23］、PET/MRI［24］等。

2 磁共振成像技術（MRI）

MRI 技術適用于活細胞藥物體內(nèi)無創(chuàng)縱向監(jiān)測，它表現(xiàn)出優(yōu)越的空間分辨率，良好的組織穿透和對比度，并能獲取病理生理和解剖信息。近年來，以氧化鐵納米顆粒作為造影劑的MRI 在活細胞藥物體內(nèi)可視化領域得到廣泛關注。Mathiasen等［25］首次在慢性缺血性心臟病患者中證明，在體使用MRI 示蹤心肌內(nèi)注射的氧化鐵納米顆粒標記的MSCs 是安全可行的，并且在移植兩周后，依然能夠在心肌部位檢測到MSCs 的磁共振信號。類似的，Xie 等［26］用氧化鐵納米顆粒標記CAR-T 細胞，在不影響細胞生物學特性和殺傷效率情況下，用MRI 技術示蹤CAR-T 細胞在膠質(zhì)母細胞瘤中的動態(tài)浸潤和滯留時間，同時證明了CAR-T 細胞用于治療膠質(zhì)母細胞瘤的早期效果。由于MRI 檢測細胞的前提是對細胞進行磁共振探針標記，因此在不影響細胞活性的情況下，更高的標記效率和更長的探針駐留時間，可使MRI 達到更好的成像效果。Egawa 等［27］利用DNA 雙鏈雜交原理，將兩個短單鏈DNA oligo［dT］20和oligo［dA］20分別與神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）和氧化鐵納米顆粒偶聯(lián)。修飾后的氧化鐵納米顆粒具有更好的細胞攝取率、更高的標記效率和更強的體內(nèi)MRI 信號，移植到大鼠腦紋狀體中的NSCs 可以通過MRI 進行長達30 d 的掃描檢測。除了氧化鐵納米粒，（19F）［28-29］、釓［30］、石墨烯氧化物［31］等也可以作為MRI 造影劑，用于活細胞藥物示蹤。Hingorani等［32］在全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）納米乳劑中加入TAT 細胞穿透肽，CAR-T 對PFC 的攝取量增加7 倍多，同時提高了19F MRI 用于體內(nèi)成像的靈敏度。但是MRI 技術時間分辨率低，無法在短時間內(nèi)進行連續(xù)成像，造成了其使用的局限性。

3 磁顆粒成像技術（MPI）

MPI 技術由荷蘭飛利浦研究所（Philips Research）于2005 年推出，是基于功能和斷層影像技術檢測磁性納米顆粒空間分布的示蹤方法，MPI信號僅由氧化鐵納米顆粒提供，而不從周圍組織中獲取，可直接對氧化鐵的強磁化進行成像［33］。MPI 具有無輻射、高信噪比、零信號衰減以及高靈敏度的特點，因此MPI 可成為體內(nèi)細胞追蹤的理想平臺。Zheng 等［34］使用MPI 在12 d 的時間內(nèi)監(jiān)測了氧化鐵納米顆粒標記的MSCs 在大鼠體內(nèi)的動態(tài)分布，標記的MSCs 注射后立即截留在肺組織中，隨后在1 d 內(nèi)轉(zhuǎn)移到肝臟，其在肝臟中的清除半衰期為4.6 d。動物處死后進一步通過MPI確定了肺、肝、脾和心臟中MSCs 的生物分布，驗證了MPI 可量化MSCs 生物分布的能力。同時，Nejadnik 等［35］也證明MPI 技術可用于氧化鐵納米顆粒標記的MSCs 體內(nèi)示蹤。研究發(fā)現(xiàn)，MPI 提供的信號能夠確認移植部位的細胞在第1 天和第14天之間存在顯著性差異，而MRI 技術提供的信號無法區(qū)分第1 天和第14 天的差別，提示MPI 定量的靈敏度和準確度顯著高于MRI。示蹤劑的性質(zhì)決定MPI 的圖像質(zhì)量，球形的氧化鐵納米顆粒是目前最主要的MPI 造影劑，但是其標記的細胞在體內(nèi)的示蹤效果遠遠不能令人滿意。因此，開發(fā)適用于MPI 的高性能磁示蹤劑對于提高MPI 的靈敏度和分辨率至關重要。Wang 等［36］通過將球形氧化鐵納米粒改成立方體氧化鐵納米粒，提高了氧化鐵納米粒的磁成像能力。這種立方氧化鐵納米粒標記的干細胞在體外成像時，通過MPI 能夠檢測到極低濃度的細胞（每微升30個細胞）。即便是在復雜的體內(nèi)環(huán)境下，不論組織深度如何（肺、肝），通過MPI 能檢測到至少2 500 個細胞。此外，由于基于立方體氧化鐵納米顆粒的MPI 具有較高的敏感性，因此可以實時揭示MSCs 在后肢缺血小鼠模型中的遷移和分布規(guī)律。由此可見，在現(xiàn)有的分子成像模式中，MPI 顯示出獨特的高靈敏度、定量準確性和縱向監(jiān)測的能力。但值得注意的是，MPI并不能提供解剖學信息。

4 計算機斷層掃描成像技術（CT）

CT 技術是臨床應用最廣泛的成像技術之一，具有成本效益高、空間分辨率高、掃描時間短、成像過程簡單等優(yōu)點，這使得CT 成為一種用于細胞示蹤的重要成像方式。目前研究發(fā)現(xiàn)金（Au）納米粒具有固有的高X 射線吸收系數(shù)，高生物相容性和無毒性，這些特點使Au 納米粒成為一種具有良好發(fā)展前景的CT 造影劑［37-38］。Betzer 等［39］發(fā)現(xiàn)使用Au 納米標記間充質(zhì)干細胞不僅幾乎不影響細胞活性和功能，還能利用CT 成像技術對移植進入大腦內(nèi)的細胞進行長期示蹤和成像。Yu等［40］成功開發(fā)了一種pH 敏感納米示蹤劑CPP-PSD@Au，用于增強體內(nèi)標記和長期CT 成像示蹤間充質(zhì)干細胞。使用該探針，實現(xiàn)了移植MSCs 在肺纖維化模型小鼠中的位置、分布和遷移長達35 d 的原位可視化。此外，為了解決傳統(tǒng)CT 技術中造影劑的圖像可能被骨組織的高強度所掩蓋、難以準確提取雙組份成像圖像的問題，最新的雙能計算機斷層掃描DECT 技術通過兩種不同能量的X 射線的照射，可以消除質(zhì)量密度對圖像信號的影響，準確地區(qū)分來自各種組織或物質(zhì)的圖像信號。Wan 等［41］利用這一技術，實現(xiàn)了干細胞在骨再生過程中長達14 d 的示蹤。然而，CT 圖像的對比度取決于組織對X 射線衰減的差異，而許多軟組織在X 射線衰減上的差異極其細微，導致無法區(qū)分相鄰組織，造成CT 成像的敏感性低、軟組織圖像對比度有限［42］。

5 熒光成像技術（FI）

FI 技術最常見的標記方式是直接標記，將熒光材料與活細胞藥物進行直接孵育，從而對細胞進行標記示蹤。Chen 等［43］利用硫化銀量子點（Ag2S QDs）對MSCs 進行標記，首次通過FI 技術在體動態(tài)監(jiān)測MSCs 在趨化因子SDF-1α 作用下向皮膚傷口遷移和分布的動態(tài)過程。Yang 等［44］利用硫化鉛量子點（PbS QD，λex= 1 300 nm）作為造影劑，不影響MSC 增殖、自我更新和分化能力。在岡上肌腱撕裂模型小鼠關節(jié)內(nèi)注射3 種不同密度MSCs，并利用FI 進行縱向監(jiān)測。成像結果發(fā)現(xiàn)3組MSCs的遷移方向相似，但遷移起始時間、停留時間和細胞在足跡周圍的滯留率差異很大。其中，中等密度組在修復階段停留時間最長，足跡周圍細胞滯留率最高，有利于愈合。

與無機量子點相比，基于有機熒光染料的納米顆粒具有出色的生物相容性和熒光穩(wěn)定性，從而成為干細胞標記示蹤的潛在替代品。吲哚菁綠是一種獲得FDA 批準的近紅外染料，Mazza等［45］利用脂質(zhì)體將其包載制成高生物相容性、高近紅外熒光信號的納米探針來標記MSCs，并使用IVIS 成像系統(tǒng)可對移植入皮下的細胞示蹤兩周，對移植進入顱內(nèi)的細胞示蹤一周。在近年來發(fā)展起來的熒光材料中，聚集誘導發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）的特性引起了生物醫(yī)學領域的廣泛關注。Yang等［46］設計了具有33%的較高量子產(chǎn)率的AIE 量子點，并在脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）中表現(xiàn)出顯著的保留能力，在傳代72 h 后的單個細胞中仍能明顯檢測到熒光信號。體內(nèi)研究表明，AIE 量子點能夠作為一種有效熒光成像造影劑，用于精確示蹤移植的ADSCs 在輻射誘導的皮膚損傷小鼠中的行為。此外，利用熒光素酶及其底物催化反應而產(chǎn)生天然光源的生物熒光成像（bioluminescence imagining，BLI），其不需要外界光照射的特點有助于避免成像過程中背景熒光和生物自身熒光信號的干擾，可用于活細胞藥物示蹤中長時間的非侵入性成像，并能提供移植后細胞存活率的信息。Rabinovich 等［47］開發(fā)了一種增強版的螢火蟲熒光素酶報告基因，它可以轉(zhuǎn)導到原代小鼠T 細胞中，并且可以提供足夠的靈敏度來示蹤小鼠體內(nèi)小于1萬個T細胞。而Santos等［48］則開發(fā)了一種使用膜錨定形式的高斯熒光素酶（extGLuc）進行生物發(fā)光T 細胞成像，該酶可在小鼠和人原代T 細胞中穩(wěn)定表達，extGLuc+細胞在體內(nèi)外均能發(fā)出更強的生物發(fā)光信號。這種成像方法能夠顯示體內(nèi)CAR-T 細胞在腫瘤中的累積、駐留，還能與腫瘤細胞伴隨成像。

6 光聲成像技術（PAI）

PAI 技術是近年來發(fā)展起來的一種非入侵式和非電離式的新型生物醫(yī)學成像方法，具有對比度高、空間分辨率高、對組織功能特征敏感等獨特的優(yōu)點，在生物醫(yī)學和臨床領域有著巨大的應用潛力。目前，Yin 等［49］報道了一種基于高分子半導體的納米探針（OSPNs+），并用PAI 技術示蹤移植進入活體小鼠的MSCs。結果顯示，與未標記的細胞相比，皮下成像和腦成像的光聲信號增強幅度分別為40.6 倍和21.7 倍。Kim 等［50］開發(fā)了一種更加簡單有效的方法，用光聲成像對普魯士藍納米顆粒（PBNPs）標記的MSCs 進行示蹤，標記的MSCs 在移植入裸鼠皮下后表現(xiàn)出強烈的光聲對比，檢出限可維持在每微升200 個細胞的較低水平。并且標記粒子的高敏感性和持久的光聲對比使得移植的5 × 104個MSCs 在裸鼠皮下能夠進行持續(xù)14 d的可視化監(jiān)測。

PAI不僅用于活細胞藥物給藥后的示蹤，還使活細胞藥物的精確靶向移植、體內(nèi)縱向示蹤成為了可能，為進一步對活細胞移植后的活性監(jiān)測提供了基礎。Donnelly 等［51］使用金納米球成功標記了MSCs，并利用超聲和光聲成像實時指導MSCs注射的針頭放置，實現(xiàn)精準遞送，改善治療效果。Dhada 等［52］使用惰性金納米棒（Au NRs）包覆活性氧（ROS）敏感的熒光染料（IR775c）作為PAI 成像造影劑。當MSCs 死亡時，胞內(nèi)ROS 含量增加，IR775c 的光聲信號增強，而Au NRs 的光聲信號對ROS 不敏感，因此MSCs 的生存情況可以通過IR775c 與Au NRs 光聲信號的比值來監(jiān)測。利用該技術進行體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，移植進入小鼠下肢肌肉的MSCs 在24 h 內(nèi)顯著死亡，10 d 后大約只剩下5%的活力。

7 多模態(tài)成像技術

每一種成像方式都有其自身的優(yōu)缺點，單獨采用一種成像方式難以滿足活細胞藥物體內(nèi)示蹤要求。因此，結合兩種或兩種以上的多模態(tài)成像方式可以相互補充，更具應用前景。

Bao等［53］開發(fā)了一種結合Au納米顆粒和螢火蟲熒光素酶（RfLuc）的雙重標記策略，在肺纖維化小鼠模型中對移植的MSCs 進行CT/BLI 雙模態(tài)成像示蹤。BLI可以監(jiān)測MSCs 在體外和體內(nèi)的生存情況，靈敏度高。但是在體內(nèi)的示蹤過程會受到低穿透深度和低空間分辨率的限制，因此配合CT成像技術，同時記錄移植后MSCs 的存活、位置和分布的準確信息。為了實現(xiàn)更靈敏的成像，Harm?sen 等［54］設計了一種非基因組標記的，基于FI/PET多模態(tài)成像的標記策略。利用FI/PET 活性納米探針標記細胞，以提供基于PET 的高靈敏度、全身成像，并同時實現(xiàn)廣域和高分辨率熒光成像，可以成功對移植后的CAR-T 細胞全身示蹤長達一周。Hua 等［55］構建了熒光/生物發(fā)光/拉曼散射（FI/BLI/SERS）三模態(tài)成像，用于示蹤MSCs 治療心肌梗死的體內(nèi)行為。近紅外二區(qū)熒光成像和生物發(fā)光成像技術能夠動態(tài)地評估標記MSCs 在體內(nèi)的分布和代謝。另一方面，SERS 能夠在心臟組織中精確定位標記的MSCs，揭示MSCs 分布和遷移模式的細節(jié)。傳統(tǒng)的多模態(tài)成像探針多采用直接標記的方法，該方法基于將成像探針主動/被動遞送到細胞內(nèi)，存在標記效率低、影響細胞活性等缺點。為了解決這些問題，Lim 等［56］利用生物正交標記策略，對MSCs 進行精確標記，利用FI/MRI 雙模態(tài)成像，對MSCs 在卒中模型鼠大腦中的遷移和分布開展長達14 d 的精確監(jiān)測。除了上述介紹的技術外，在當前的研究中還有CT/FI［57］、CT/MRI［58］、FI-MRI［59］、PAI-FI［60］等技術，故多模態(tài)成像是克服單一成像方法不足最高效、實用的策略。

8 結 語

本文總結了各種成像技術用于活細胞藥物示蹤的研究進展，各種成像技術的優(yōu)缺點如表1 所示。然而單一成像技術的應用往往存在許多的局限性，不能全面地了解活細胞在體內(nèi)的動態(tài)過程。在今后的研究中，應該更加注重多種成像技術相結合，從更多的維度去研究活細胞藥物的體內(nèi)過程。在各種成像技術中，探針不可或缺，但是當前所選用的探針普遍存在伴隨細胞增殖后稀釋、在細胞的生理活動過程中可能被排出、被其它細胞非特異性吞噬等問題，導致不能準確提供移植細胞的體內(nèi)示蹤信息。因此，結合多模態(tài)檢測的發(fā)展趨勢，克服探針現(xiàn)有的弊端，開發(fā)新型探針及其標記技術，將提高活細胞藥物體內(nèi)示蹤的準確性和特異性，促進活細胞藥物的體內(nèi)動態(tài)過程研究，為活細胞藥物的研發(fā)和臨床應用提供科學依據(jù)。

表1 各種活細胞藥物體內(nèi)成像技術的比較