宋士良

（上海邦成生物工程有限公司，上海 201506）

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，1900年首先從嬰兒糞便中分離出來，當(dāng)時(shí)被命名為嗜酸芽孢桿菌(Bacillus acidophilus)。1970年經(jīng)Hanson和Moquot重新鑒定、分類后，修改為現(xiàn)在的名稱，屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性桿菌（Widyastuti等，2014）[1]。嗜酸乳桿菌是少數(shù)可以存活并定植于人或動(dòng)物腸道內(nèi)的益生菌之一，其在腸道內(nèi)的定植能力強(qiáng)于其它微生物。它能競(jìng)爭(zhēng)性地定植于小腸上皮細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)菌素和有機(jī)酸，維持腸道內(nèi)低pH環(huán)境，促進(jìn)腸道中微生態(tài)環(huán)境的正?；⊿capin等，2013）[2]。嗜酸乳桿菌作為動(dòng)物腸道中重要的益生菌，具有維護(hù)動(dòng)物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、改善飼養(yǎng)環(huán)境、調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝和改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)等功能（胡國(guó)才等，2013）[3]。La-0231菌株分離自仔豬新鮮糞便，經(jīng)16SrDNA測(cè)序及生理生化特性鑒定確認(rèn)其為嗜酸乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 分離源仔豬新鮮糞便。

1.1.2 分離培養(yǎng)基MRS（含溴甲酚紫）固體培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸粉5g，檸檬酸氫二銨2g，K2HPO42g，NaAc·3H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐溫80 1mL，蒸餾水定容1000mL，瓊脂20g，pH6.0～6.5，0.6%溴甲酚紫1mL。

1.1.3 牛奶管保種培養(yǎng)基脫脂奶粉10g，酵母膏2g，葡萄糖1g，蒸餾水100mL。

1.1.4 鑒定培養(yǎng)基MRS固體培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，檸檬酸氫二銨2g，K2HPO42g，NaAc·3H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐溫80 1mL，蒸餾水定容1000mL，瓊脂20g（MRS液體培養(yǎng)基不加瓊脂），pH6.0～6.5。

1.1.5 細(xì)菌生化鑒定管 苦杏仁苷、水楊苷、七葉靈、纖維二糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖、接觸酶等的細(xì)菌生化鑒定管。

1.1.6 定量抗生素紙片標(biāo)準(zhǔn)品 實(shí)驗(yàn)用定量抗生素紙片標(biāo)準(zhǔn)品，由中國(guó)食品藥品檢定研究院出品。

1.1.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康成年ICR小鼠80只，雌雄各半，雌性小鼠體重范圍17.92g～21.89g，雄性小鼠體重范圍19.20g～22.79g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離純化步驟

①將采集的仔豬新鮮糞便逐級(jí)稀釋，取0.1mL稀釋液涂布于MRS（含溴甲酚紫）固體培養(yǎng)基平板（下同）上，37℃兼性厭氧培養(yǎng)2d。

②將培養(yǎng)好的平板取出，選取所有菌落形態(tài)為黃色、表面濕潤(rùn)、平凸、邊緣整齊、大小在0.5mm～2.5mm的單菌落，對(duì)應(yīng)作標(biāo)記，在無菌條件下挑取作記號(hào)的菌落，革蘭氏染色，保留鏡檢形態(tài)為桿菌、兩端圓、大小通常為0.6μm×1.5μm～0.9μm×6.0μm，以單個(gè)、成雙或短鏈出現(xiàn)的單菌落，并將平板上保留的單菌落標(biāo)記為嗜酸乳桿菌疑似菌株。

③將疑似菌株采用劃線的方式轉(zhuǎn)接到空白平板上，37℃，兼性厭氧培養(yǎng)2d，進(jìn)行初步的菌株純化。

④選取上述相同菌落形態(tài)的單菌落，再劃線轉(zhuǎn)接到空白平板上，37℃兼性厭氧培養(yǎng)2d，進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行純化。反復(fù)多次，直至鏡檢無雜菌。

⑤選取上述相同菌落形態(tài)的單菌落，轉(zhuǎn)接到保種牛奶管中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)15h，2℃～4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種鑒定

①生理生化特性鑒定。采用細(xì)菌生化鑒定管法測(cè)定。

②16SrDNA測(cè)序。分離、純化菌種，委托上海美吉生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)16SrDNA基因作為Marker片段，通用引物擴(kuò)增出基因中16SrDNA序列，再進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行一代雙末端測(cè)序，獲得abi測(cè)序峰圖文件，通過軟件組裝后，與NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得近源物信息。

1.2.3 抗生素敏感試驗(yàn) 采用K-B法測(cè)定。

1.2.4 菌株毒力試驗(yàn)

①培養(yǎng)物制備。將嗜酸乳桿菌La-0231菌株轉(zhuǎn)接至MRS固體培養(yǎng)基上，37℃兼性厭氧培養(yǎng)48h；挑取單菌落轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)48h后，將部分培養(yǎng)液常溫下濃縮5倍備用，其余直接供實(shí)驗(yàn)用。

②活菌計(jì)數(shù)。無菌吸取上述①中培養(yǎng)液1mL，加入9mL無菌生理鹽水稀釋液中混勻，并進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇合適的2～3個(gè)稀釋度，吸取0.1mL稀釋液分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度2塊平板，置37℃，兼性厭氧培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)。

③小鼠毒力試驗(yàn)。小鼠80只，雌雄各半，分別隨機(jī)分為4組。劑量組設(shè)置為：培養(yǎng)基空白對(duì)照組、培養(yǎng)基5倍濃縮空白對(duì)照組、培養(yǎng)物原液組、培養(yǎng)物5倍濃縮組。將受試物以0.02mL/g體重的劑量給小鼠灌胃，連續(xù)灌服3d，觀察7d，記錄實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的中毒表現(xiàn)或死亡情況。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以下試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為2次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2016處理后，定量測(cè)定數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離鑒定

2.1.1 菌株分離純化

試驗(yàn)采用仔豬新鮮糞便，逐級(jí)稀釋涂布平板培養(yǎng)，從菌落形態(tài)、菌體顯微形態(tài)、革蘭氏染色著手挑取單菌落，再經(jīng)反復(fù)多次劃線分離菌種，獲得純化菌株。該純化菌株菌落形態(tài)、菌體顯微形態(tài)和革蘭氏染色特征見圖1。

圖1 純化菌株菌落形態(tài)、菌體顯微形態(tài)和革蘭氏染色特征

2.1.2 生理生化特性鑒定結(jié)果

采用劃線的接種方式，將牛奶管中保存的菌種，轉(zhuǎn)接到MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃兼性厭氧培養(yǎng)2d，進(jìn)行菌種純化。挑取培養(yǎng)好的單菌落，轉(zhuǎn)接到MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃兼性厭氧培養(yǎng)2d，收集培養(yǎng)好的菌苔，進(jìn)行菌種的細(xì)菌生化管鑒定。鑒定結(jié)果見表1。

表1 嗜酸乳桿菌La-0231菌株細(xì)菌生化管鑒定結(jié)果

從表1的檢測(cè)結(jié)果可以看出，La-0231菌株能利用葡萄糖產(chǎn)乳酸；接觸酶陰性；能在pH4.5，15℃～45℃溫度環(huán)境下，厭氧或好氧生長(zhǎng)；能發(fā)酵牛奶產(chǎn)酸凝固；能利用苦杏仁苷、水楊苷、七葉靈、纖維二糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖等碳水化合物產(chǎn)生乳酸。生理生化特性鑒定為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。

2.1.3 16SrDNA測(cè)序結(jié)果

采用劃線的接種方式，將牛奶管中保存的菌種，轉(zhuǎn)接到MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃兼性厭氧培養(yǎng)2d，進(jìn)行菌種純化。挑取培養(yǎng)好的單菌落，轉(zhuǎn)接到MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃兼性厭氧培養(yǎng)2d。分離、純化好的菌種，經(jīng)16SrDNA基因作為Marker片段，通用引物擴(kuò)增出基因中16SrDNA序列，獲得其特征序列圖，見圖2。

從圖2的測(cè)序結(jié)果可以看出，La-0231菌株其16SrDNA序列為1460bp，與嗜酸乳桿菌模式菌株KLDS 1.0701進(jìn)行比對(duì)，其16SrDNA基因序列相似性達(dá)99.86%，鑒定結(jié)果為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。

圖2 嗜酸乳桿菌La-0231菌株16Sr DNA特征序列

2.2 菌株特性分析

2.2.1 抗生素敏感性測(cè)試結(jié)果

采用K-B法，測(cè)定嗜酸乳桿菌La-0231菌株對(duì)30種抗生素的敏感性。檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 嗜酸乳桿菌La-0231菌株對(duì)30種抗生素的敏感性測(cè)試結(jié)果

從表2的測(cè)試結(jié)果可以看出，嗜酸乳桿菌La-0231菌株對(duì)青霉素、羧芐青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、克拉霉素、氯霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、呋喃妥因、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、復(fù)方新諾明敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感；對(duì)氟羅沙星、洛美沙星、諾氟沙星不敏感。

2.2.2 菌株毒力測(cè)試結(jié)果

①培養(yǎng)物原液中活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

將嗜酸乳桿菌La-0231菌株轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)48h后，對(duì)培養(yǎng)物原液進(jìn)行10倍梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養(yǎng)物原液中活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

從表3的檢測(cè)結(jié)果可以看出，培養(yǎng)物中的活菌數(shù)為2.65×108CFU/mL或2.70×108CFU/mL，兩個(gè)稀釋度檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。

②培養(yǎng)物對(duì)小鼠體重的影響

將嗜酸乳桿菌La-0231菌株轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃兼性厭氧培養(yǎng)48h后，將部分培養(yǎng)液常溫下濃縮5倍，其余培養(yǎng)液直接供試驗(yàn)用。分別試驗(yàn)對(duì)雄性小鼠體重和雌性小鼠體重的影響。結(jié)果見表4、表5。

表4 嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養(yǎng)物對(duì)雄性小鼠體重的影響

從表4的檢測(cè)結(jié)果可以看出，雄性小鼠的初始體重和終體重在培養(yǎng)物組與其相應(yīng)的對(duì)照組間比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。即在試驗(yàn)期間，嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養(yǎng)物對(duì)雄性小鼠體重?zé)o影響。

表5 嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養(yǎng)物對(duì)雌性小鼠體重的影響

從表5的檢測(cè)結(jié)果可以看出，雌性小鼠的初始體重和終體重在培養(yǎng)物組與其相應(yīng)的對(duì)照組間比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。即在試驗(yàn)期間，嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養(yǎng)物對(duì)雌性小鼠體重?zé)o影響。

③活菌對(duì)小鼠毒性作用結(jié)果

將受試物以0.02mL/g體重的劑量給小鼠灌胃，連續(xù)灌服3d，觀察7d，記錄實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的中毒表現(xiàn)或死亡情況。結(jié)果見表6。

表6 嗜酸乳桿菌La-0231菌株活菌對(duì)小鼠毒性作用情況

從表6的檢測(cè)結(jié)果可以看出，以0.02mL/g體重劑量嗜酸乳桿菌La-0231菌株活菌培養(yǎng)物（原液和濃縮液），給小鼠灌胃，連續(xù)灌服3d，觀察7d，未見受試小鼠有毒性反應(yīng)或死亡情況。

3 討論

3.1 菌株分離鑒定

張雅茹等（2017）從青海酸奶中分離出一株嗜酸乳桿菌，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)和16SrDNA序列同源性分析鑒定確認(rèn)，并對(duì)其進(jìn)行了降血脂的研究[4]。吳家鑫等（2019）從廣西桂林市黃洛瑤寨地區(qū)淘米水發(fā)酵液中分離得到3株嗜酸乳桿菌疑似菌株，其中3號(hào)菌株菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、革蘭氏染色符合嗜酸乳桿菌特征；46項(xiàng)生理生化指標(biāo)與嗜酸乳桿菌接近，鑒定可信度達(dá)到90%；經(jīng)過16SrDNA鑒定后，其與嗜酸乳桿菌的同源性高達(dá)99%，確認(rèn)其為嗜酸乳桿菌，命名為CFC-001[5]。王麗等（2017）從健康雞腸道中分離獲得3株疑似乳桿菌，并對(duì)其分別命名。通過對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌試驗(yàn)，以及耐受性試驗(yàn)獲得一株益生效果較高的菌株S-3，通過傳統(tǒng)的形態(tài)、生理生化方法和16SrDNA分子鑒定，確定S-3為嗜酸乳桿菌[6]。蔡熙姮等（2020）從藍(lán)狐的腸道內(nèi)容物中分離到1株優(yōu)勢(shì)乳酸菌，命名為ZJBF300。經(jīng)菌落形態(tài)、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析將其鑒定為嗜酸乳桿菌[7]。胡國(guó)才等（2015）從仔豬新鮮糞便中分離純化了1株嗜酸乳桿菌菌株La-5，通過逐步提高培養(yǎng)基酸度、膽鹽濃度和培養(yǎng)溫度，對(duì)分離菌株進(jìn)行馴化，獲得一株具有耐低pH、高濃度膽鹽及高溫特性的菌株La-5c[8]。杜志琳等（2016）從健康豬腸道內(nèi)容物中分離獲得5株疑似乳桿菌菌株，通過生理生化和分子生物學(xué)鑒定方法，綜合確定其中一株菌為嗜酸乳桿菌，命名為HEW-A701。并對(duì)其耐酸性能、耐膽鹽性能和對(duì)致病菌拮抗性能進(jìn)行研究[9]。張艷萍等（2017）從健康仔豬糞便中分離獲得9個(gè)菌株，通過對(duì)菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定，得到2株疑似嗜酸乳桿菌菌株，分別命名為L(zhǎng)102和L106，通過16SrDNA分析表明，菌株L102和L106均為嗜酸乳桿菌，并對(duì)2株菌的益生特性進(jìn)行研究[10]。梁東梅等（2018）選取健康豬糞便，利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)和單克隆純化，共獲得3株乳酸桿菌，通過生化鑒定、16SrRNA基因序列測(cè)定和同源性分析，確定其中一株分離菌株為嗜酸乳桿菌。采用牛津杯法、活菌計(jì)數(shù)法和細(xì)胞試驗(yàn)等研究了其體外抑菌活性、黏附性及競(jìng)爭(zhēng)性黏附豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)的益生特性[11]。本試驗(yàn)從菌落形態(tài)、菌體顯微形態(tài)、革蘭氏染色著手，分離、純化菌種，通過生理生化特性和16SrDNA基因序列分析，將其鑒定為嗜酸乳桿菌，命名為L(zhǎng)a-0231菌株。

3.2 菌株特性分析

杜金城（2017）測(cè)試了4株嗜酸乳桿菌（KLDS1.0901、1.0902、1.1003和NCFM）對(duì)10種抗生素（青霉素、阿莫西林、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福平、萬古霉素和氯霉素）的敏感性，結(jié)果KLDS1.0901菌株對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素、鏈霉素和卡那霉素耐受，對(duì)其余7種抗生素敏感；KLDS1.0902菌株對(duì)慶大霉素和卡那霉素耐受，對(duì)其余8種抗生素敏感；KLDS1.1003菌株與KLDS1.0902菌株一致；NCFM菌株對(duì)慶大霉素、鏈霉素和卡那霉素耐受，對(duì)四環(huán)素和利福平中介，對(duì)其余5種抗生素敏感[12]。于鴻晶等（2019）采用最低抑菌濃度法檢測(cè)嗜酸乳桿菌YIT2004菌株對(duì)抗生素的敏感性，提取YIT2004菌株基因組，用特異性引物對(duì)耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示嗜酸乳桿菌YIT2004菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、亞胺培南、慶大霉素、紅霉素和克林霉素敏感，對(duì)萬古霉素固有耐藥且其耐藥性不可傳遞[13]。本試驗(yàn)采用K-B法，測(cè)定了嗜酸乳桿菌La-0231菌株對(duì)30種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示其對(duì)22種抗生素敏感，對(duì)5種抗生素中度敏感，對(duì)3種抗生素不敏感。毒力試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果說明，嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養(yǎng)物對(duì)雄性和雌性小鼠體重?zé)o影響；以0.02mL/g體重劑量活菌培養(yǎng)物（原液和濃縮液），給小鼠灌胃，未見受試小鼠有毒性反應(yīng)或死亡情況。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用仔豬新鮮糞便，從菌落形態(tài)、菌體顯微形態(tài)、革蘭氏染色著手，分離、純化菌種，通過生理生化特性和16SrDNA基因序列分析，將分離純化菌株鑒定為嗜酸乳桿菌，命名為L(zhǎng)a-0231菌株。采用K-B法，測(cè)定了嗜酸乳桿菌La-0231菌株對(duì)30種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示其對(duì)青霉素、羧芐青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、克拉霉素、氯霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、呋喃妥因、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、復(fù)方新諾明敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感；對(duì)氟羅沙星、洛美沙星、諾氟沙星不敏感。毒力試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果說明，嗜酸乳桿菌La-0231菌株對(duì)動(dòng)物安全，是一株有待開發(fā)利用的豬源嗜酸乳桿菌。